柴胡中柴胡皂甙a 与d 对映体的分离检测方案(毛细管电泳仪)

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第36卷 第5期Vol.36 No.52006年10月Oct. 2006山 东 大 学 学 报 (工 学 版)JOURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY (ENGNEERING SCIENCE) 第5期121丁原菊，等：毛细管电泳法对柴胡中柴胡皂甙a与d对映体的分离和测定 文章编号：1672-3961(2006)05-0120-05 毛细管电泳法对柴胡中柴胡皂甙a与d对映体的分离和测定 丁原菊，陆玮洁，主沉浮，高建军，贾(山东大学 化学与化工学院，山东 济南 250100) 摘要：利用环糊精衍生物2-O丙酮基-2-0羟丙基-环糊精(2-AHP-β-CD)作为手性选择剂，提出了一种毛细管电泳快速分离、测定柴胡中柴胡皂甙a，d对映体的方法.考察了手性选择剂浓度、缓冲液浓度及其pH值对分离效果的影响，确定了最佳分离条件.结果表明，在214nm检测波长处，在硼砂缓冲溶液中，2-AHP-B-CD能使柴胡皂甙a ，d异构体在7 min 内得到分离.利用该法测定了柴胡中柴胡皂甙a，d的含量，并进一步研究了方法的线性范围、检测限及精密度. 关键词：柴胡；柴胡皂甙；环糊精衍生物；毛细管电泳 中图分类号：O657.8 文献标识码：A Separation and determination of saikosaponin isomer a and d inBupleurum by capillary zone electrophoresis DING Yuanju， LU Wei-jie， ZHU Chenfu，GAO Jian-jun， JIA Jiong (School of Chemistry and Chemical Engineering， Shandong University， Jinan 250100，China) Abstract： A fast capillary zone electrophoresis (CZE) method was developed for the separation and determina-tion of saikosaponin a and d isomer in the Chinese herbal extract in Bupleurum. A highly water soluble cyclo-dextrin (CD) derivative 2-0-Acetonyl-2-O-hydroxypropyl-B-CD (2-AHP-B-CD) was tested as an effectivechiral selector for the capillary zone electrophoretic resolution of saikosaponin a and disomer. Detection at 214nm with a system containing sodium borate buffer and 2-AHP-B-CD is found to be the most suitable approachfor this analysis. The chiral resolution is strongly influenced by the concentration of the 2-AHP-B-CD， the concentration of buffer and buffer pH. The compounds studied can be enantiomerically resolved in less than 7 minutes with no capillary treatment. Furthermore ， the linearity range， quantitation limit for the crude drug extractin Bupleurum and the precision of the measurements were determined. Key words： saikosaponins； Bupleurum；B-Cyclodextrin derivative ； capillary zone electrophoresis 0 引言 柴胡为著名传统中药，具有表和里、疏肝解郁等功效，在我国已有二千多年的应用历史.柴胡的主要成分为柴胡皂甙，其中柴胡皂甙a，d对映体具有抗 炎、保肝、降低血中胆固醇等药理活性.关于柴胡皂甙a，d的分离测定，文献报道的方法有比色法液滴逆流层析法薄层扫描法“等.这些方法操作比较繁琐，准确度和精密度也不够高.高效液相色谱法分离测定柴胡皂甙的报道亦有出现，但这类方法所用试剂价格较高或使用有机溶剂较多，对环境影 ( 收稿日期：2005-12-02 ) ( 作者简介：丁原菊(1952-)，女，山东临沂人，大学毕业，高级工程师，主要研究方向为高分子化学. ) 响较大15.6】；而且分离时间较长(大约30 min).有的应用示差折光检测，方法仍不够简便.高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis，HPCE)是近十几年迅速发展起来的一种新型分离分析技术，具有分离效率高、分析速度快分离模式多、所需样品少、应用范围广、自动化程度高的特点18~111.在生命科学、生物技术、医学药物和环境科学等领域显示了极其重要的应用前景，目前正广泛应用于天然药物的研究之中.笔者以环糊精及其衍生物作为手性选择剂12~151，利用毛细管电泳法对柴胡中的皂甙a，d进行了分离测定，结果表明该法具有快速、简便，且消耗试剂少，不污染环境的特点，具有一定的优越性. 1 试验 1.1 仪器 RE-100型旋转薄膜蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂) ，ACS 2000 高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器有限公司)，pHS-25型酸度计(上海雷磁仪器厂)，石英毛细管60 cm X50 um(i.d.)，有效长度为50 cm(河北永年光导纤维厂)，0.45 um纤维素脂膜(上海市新亚净化器件厂). 1.2 试剂与药品 柴胡皂甙a，d(批号：SKH050317)从成都思科华生物技术有限公司购买，均为含量测定对照品，其结构式如图1所示. 柴胡皂甙a：R—Gc-Fuc →； R22·——CHOH； R3 -B-OH.柴胡皂甙d：R，——GcFuc→：R2——CHOH；R ：—6-OH. 图1 柴胡皂甙a、d结构式 Fig.1 Molecular structure of saikosaponins 环糊精衍生物：2-丙酮基-2-羟基基环糊精衍生物(2-AHP-B-CD)由实验室自己合成.结构式如图2所示. 图 2 2-O丙酮基-2-O羟丙基环糊精衍生物结构式 Fig.2 Molecular structure of 2-AHP-B-CD 式中，7-n与m分别为相应的丙酮基与羟丙基的平均取代度.n和m值由反应物比例控制并通过HNMR测定(产物为n=4.8，m=1). 硼砂 (Na4B207)、硼酸(HBO4)、氢氧化钠(NaOH)、无水乙醇均为分析纯试剂；pH缓冲溶液由0.1mol/L 硼酸或0.1 mol/L 氢氧化钠溶液调节；水为二次蒸馏水. 1.3 标准溶液的配制 将柴胡皂甙a，d标准品分别用乙醇配成质量浓度1mg/mL的标准溶液，使用过程中用二次蒸馏水稀释为所需浓度. 精密称定柴胡生药粉末(过60目筛)1.0000 g(产地：山东；购自山东中医药大学药材仓库)，放入50mL三角烧瓶中，加入20mL乙醇(内含0.5%吡啶，防止柴胡皂甙a，d在提取过程中发生酸性水解)，至超声波振荡器中萃取1h.重复萃取3次，合并萃取液，并用旋转薄膜蒸发仪浓缩至3mL左右，至5mL容量瓶中定容.在进样前用0.45 um纤维素脂膜过滤. 1.5 实验方法 毛细管在使用之前用1ml/L的 NaOH溶液充 满放置1h，然后用二次蒸馏水洗5 min. 2 次运行之间依次用0.5mol/L的 NaOH溶液洗 2 min，二次蒸馏水水洗2 min，背景电解质洗2min.所用溶液均经0.45 um纤维素脂膜过滤，采用电动进样，在20kV进样5s，分离电压为20kV，检测波长214 nm. 2 结果与讨论 2.1 手性选择剂2-AHP-B-CD浓度对分离度的影响 从图1中可以看到，柴胡皂甙a，d为一对对映体，用本实验室合成的2-AHP-B-CD 作为手性选择剂，考察了其浓度对柴胡皂甙a和d分离度的影响，结果见图3. 图3 2-AHP-B-CD浓度对分离度的影响 Fig.3 Effects of 2-AHP-B-CD concentration on the resolution 电泳条件：硼砂浓度：40 mmol/L；缓冲液pH值：8.0；分离电压：20kV；电动进样：5s；温度：22℃；紫外波长：214 nm. 由图3可以看到，当2-AHP-B-CD的浓度小于5 mmol/L时，柴胡皂甙类化合物的分离度随着2-AHP-B-CD的浓度增加而增大；当2-AHP-B-CD的浓度大于5mmol/L时，柴胡皂甙类化合物的分离度随着2-AHP-B-CD 的浓度增加而降低，由此可知，2-AHP-B-CD的浓度为5 mmol/L时最为合适. 2.2 缓冲液 pH值的影响 缓冲液pH值影响待分离物质的电荷及电渗流，是影响手性分离的重要参数之一.由于柴胡皂甙在酸性条件下水解，因此考察了pH值在8.0~10.0时的影响.实验结果如图4. 电泳条件：硼砂浓度：40 mmol/L；2-AHP-B-CD的浓度为5 mmol/L；分离电压：20kV；电动进样：5s；温度：22℃；紫外波长：214 nm. 实验结果表明，随pH值的增大，皂甙类化合物的分离度降低，所以pH值=8.0时为最佳选择. 图4 pH值对分离度的影响 Fig. 4 Effects of pH on the resolution 2.3 硼砂浓度对分离度的影响 固定pH值为8.0和浓度为 5 mmol/L手性选择剂浓度不变，改变硼砂浓度考察其对分离度的影响.实验结果如图5. 图5 硼砂的浓度对分离度的影响 Fig.5 Effects of borate concentration on the resolution 电泳条件：缓冲液pH 值：8.0；2-AHP-B-CD 浓度：5 mmol/L；分离电压：20kV，电动进样：20 kV/5s；温度：22℃；检测波长：214nm 实验证明，柴胡皂甙类化合物的分离度随硼砂浓度的增大而增大，峰型变得较为对称，拖尾减少.考虑到在较大缓冲液浓度时，电流值较大，选用硼砂浓度 40 mmol/L 作为分离条件. 2.4 分离电压 加大毛细管柱两端的电泳电压能够缩短分析时间，但当电压增加到一定程度时，焦耳热不易散发，使缓冲溶液粘度降低，迁移率增加，柴胡皂甙类化合物的分离度下降.另外电泳电压加大后，还会使仪器的噪音明显增大.综合考虑，本实验选用20 kV的电泳电压，既能使柴胡皂甙类化合物有较好的分离度和较快的迁移时间，又保持了仪器的低噪音. 2.5 标准品与样品的分离图谱 在前面讨论的最佳电泳条件下，柴胡皂甙a，d的分离谱图如图6所示.图6分别为标准品的分离 图谱和样品的分离图谱(标准溶液样品质量浓度为1mg/ml). 0.15 0.10 0.05 www4 0.00 3.0 8.0 0.15- 0.10 0.05 0.00 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 t/min (b) 样品(Sample) 图6 标准品和样品的电泳图谱 Fig.6 The electropherograms of the standards mixture solutionand the real samples 电泳条件：缓冲液pH值8.0；2-AHP-B-CD浓度：5 mmol/L；硼砂浓度：40 mmol/L；分离电压：20kV；电动进样：20 kV/5 s；温度：22℃；检测波长：214 nm 2.6 线性实验 分别精密量取柴胡皂甙a，d标准溶液各1mL，逐级稀释，制成一系列浓度的溶液，在最佳分离条件下，测定其出峰面积.并以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归，结果如表1所示. 表1 线性回归实验结果 Tab. 1 The results of regression analysis on calibration curvesand the detection and the detection limits 回归方程 相关 样品 y=a+bx 系数 柴胡皂甙d y=4.973+8.010x 0.9994 线性范围 检测限 /(ugml )/(ug ml 50~1000 25 柴胡皂甙a y=6.004+5.215x0.9996 50~1000 25 2.7 重现性和精密度实验 重复进样6次，迁移时间和峰面积的标准偏差分别在1.1%~2.1%和2.6%~4.5%范围内.采用标准加入法测定，柴胡皂甙a和d的回收率范围为97.1%~100.9%. 用高效毛细管电泳(HPCE)和高效液相色谱法(HPLC)在最佳实验条件下，对市售柴胡样品中柴胡皂甙的含量进行了测定，其分离谱图如图6(b)所示.测定结果如表2.由表2可以看出，用两种方法测定的结果基本一致. 表2 柴胡皂甙含量测定结果 Tab. 2 Contents of two flavonoids in the herbal plant ofBupleurum(n=6) 方法 样品 含量/% RSD/% HPLC 柴胡皂甙d 0.50 2.7 柴胡皂甙a 0.78 4.2 HPCE 柴胡皂甙d 0.56 3.9 柴胡皂甙a 0.71 3.4 3 结论 用 2-AHP-B-CD 作为手性选择剂，利用毛细管电泳法对柴胡中的柴胡皂甙a，d对映体进行了分离和测定.实验结果表明，在最佳实验条件下，二者得到了基线分离.该方法具有快速、简便等特点，亦可用于其它天然药物的研究. 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