动物源性食品中克伦特罗检测方案(液相色谱仪)

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采用安捷伦三重四极杆液质联用系统对动物源性食品中β-受体激动剂类兽药残留进行分析 应用简报 食品检测和农业 作者 摘要 李建中，薄涛，郭启雷， 吴翠玲，安蓉，张之旭 安捷伦科技(中国)有限公司 本文采用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统/6495三重四极杆液质联用系统，建立了同时检测动物源性食品中18种β-受体激动剂类兽药(包括克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇等)的分析方法。该方法在 0.05-10 ng/mL 浓度范围内线性相关性良好，相关系数R'≥0.990；在添加浓度 0.05 pg/kg下，各化合物峰面积稳定性在0.6%-5.8%之间；各化合物定量下限均可达到 0.05 ug/kg。通过对方法灵敏度、精密度和线性范围等方法学参数进行考察，得到所建立的方法能在15 min 内对动物源性食品中18种β-受体激动剂类目标化合物完成快速、高灵敏度的检测分析，完全满足法规监测要求。 前言 瘦肉精主要是指肾上腺素类药物，又称β-受体激动剂(B-agonist)，用于治疗支气管哮喘、慢性支气管炎和肺气肿等疾病。瘦肉精添加在饲料中可以促进动物的快速增长、减少脂肪含量、提高瘦肉率，但其在肉制品中的残留会对消费者的身体健康造成损害。鉴于“瘦肉精”对消费者的潜在危害性，农业部1997年发文禁止瘦肉精在饲料和畜牧生产中使用，2001年和2002年，农业部分别下发文件禁止食品动物使用β-激动剂类药物作为饲料添加剂(农业部 176 号、193号公告、235号公告、560号公告、1519号条例)1-3。近年来，在畜产品中非法使用瘦肉精的食品安全事件仍然频发，如双汇瘦肉精事件、浙江毒饲料事件等等。目前各级农产品、食品安全监管部门不断加大监督检查力度，以确保消费者的健康与安全。 在早期，β-受体激动剂类兽药多采用气质联用仪来进行检测，但采用此方法需要样品衍生后再测定，且灵敏度有限。近10年来，随着液质联用系统和相关技术的发展、普及，以及对此类禁用药物越来越苛刻的检出限要求，LC/QQQ技术已成为动物源性食品中β-受体激动剂类兽药残留的主要检测和确证技术手段，被广泛应用于监督监管中。目前国内检测β-受体激动剂类药物的主要参照标准包括：《GB/T22286-2008动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液液色谱串联质谱法》、《农业部1025号公告-18-2008动物源性食品中β-受体激动剂残留检测液夜色谱-串联质谱法》14-91等。由于属于禁用药物，其检出为]“零允许量”(Zero tolerance)， 考虑到 LC/QQQ 的检测灵敏度，克伦特罗最低检出限为 0.05 pg/kg，其他β-受体激动剂检出限为0.1 pg/kg。 针对此类禁用药物严苛的监测需求，本文采用 Agilent 1290Infinity 液相色谱系统/6495三重四极杆液质联用系统，建立了同时快速检测常见的18种β-受体激动剂类兽药的可靠定量方法。该方法可以满足动物肌肉、内脏和饲料等动物源性食品中β-受体激动剂残留量的检测要求。 实验部分 试剂与化学品 所有试剂和溶剂均为色谱纯或者分析纯级。甲醇和乙腈购自德国默克 (MERCK)。甲酸和乙酸铵购自美国 Sigma-Aldrich 公司。β-受体激动剂标准品及同位素内标购自Dr.Ehrenstorfer(德国奥格斯堡)。所用实验用水为 MilliporeMilli-Q超纯水系统现制备的高纯去离子水。 ( 仪器配置 ) 实验采用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统进行分离，其由下列部件组成： ( · Agilent 1290 Infinity二元泵 (G4220A) ) ( · Agilent 1290 Infinity 标准自动进样器 ( G 4226A) ) ( · Agilent 1290 Infinity 取样冷却器 (G1330B) ) 采用配有安捷伦喷射流 (AJS) 电喷雾离子源和 iFunnel 离子传输聚焦技术的 Agilent 6495 三重四极杆液质联用系统，在正离子模式下进行检测。 采用 Agilent MassHunter 工作站软件(B.07版本)进行数据采集和分析。 标准溶液配置 所有β-受体激动剂标准品用甲醇配制为浓度1 mg/mL 的储备液，储存在-20°℃冰箱内(有效期1年左右)。用乙腈：水(50：50)混合溶剂将储备液配制为 10 pg/mL的混合标准溶液，储存在4℃下(有效期1个月左右)。使用时，用乙腈：水(10：90)混合溶剂将 10 pg/mL 混合标准溶液进行适当逐级稀释，临用新制。 样品前处理 称取2g左右的均质样品(精确至0.1g)， 依次添加 20mL的 0.2 mol/L 乙酸铵缓冲液和 50 pL 的 10000 units/mg β-葡萄糖甙酶/芳基硫酸酯酶，混合均匀后，37°C下反应过夜(14-16 h)， 取出冷却后， 5000 r/min 离心5 min， 移取上层清液，加0.1%高氯酸溶液调节pH至1.0±0.3， 5000 r/min 离心5 min， 再次移取上层清液，加10 mol/L NaOH 溶液调节 pH至11.0，依次加入10mL 饱和 NaCI 溶液和 10 mL 异丙醇：乙酸乙酯(6：4)混合溶液，萃取后离心，取有机相，氮气下吹至近干后，用5mL乙酸铵缓冲液溶解，待净化。 依次用甲醇、水活化 Agilent Bond Elut Plexa PCX 固相萃取(SPE)， 将上述复溶样品溶液全部转移到 SPE 柱上，依次用2%甲酸溶液和甲醇淋洗柱子除去基质，最后用5%氨化甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干后用液相色谱起始流动相溶解，定容至1mL， 过滤或高速离心后待测。 液相色谱条件 表1.化合物 MRM 参数列表 (D9-Clenbuterol) 380 380 15 30 化合物 母离子子离子碎裂 碰撞碰撞池保留 (m/z) (m/z) 电压 能量加速器时间 244.1 380 10 (V) (V) 电压 (min) (V) 185 25 3.4 222.1 380 8 3.46 148 15 3.49 D3-沙丁胺醇 (D3-Salbutamol) 243.2 151.2 380 15 3 3.49 西马特罗 (Cimaterol) 202.1 380 8 3 3 3.6 160.1 15 160 380 10 4.56 143 30 286.2 380 10 3 135.2 15 164.1 380 10 121 22 307.2 167.1 380 13 263 245 380 10 203 15 196.1 380 8 3 154 15 172 380 8 154 15 203 380 22 30 15 349 380 10 (Penbutolol) 201 20 如图1所示，采用配有 Poroshell 120 EC-C18色谱柱(薄壳型填料，3.0x100 mm， 2.7 um)的安捷伦三重四极杆液质联用系统，可在 15 min 内对 0.1 ng/mL 混合标准溶液中18种β-受体激动剂类兽药进行有效分离，且分离效果及峰形均能满足方法要求。 Poroshell 120 EC-C18色谱柱具有较高柱效、较低柱压和较高载样量等特点，非常适合分析动物源性样品基质中的多药物残留。流动相中添加了0.1%甲酸和2.5mmol/L 乙酸铵，可以有效促进正模式下的离子化效率。 通过 S/N≥10，计算得到18种β-受体激动剂类兽药的定量下限均可达到0.05 pg/kg， 完全满足动物源性食品中β受体激动剂类兽药的限量检测要求。 图1.18种β-受体激动剂类兽药混合标准溶液 (0.1 ng/mL)的 MRM 叠加图 6495三重四极杆液质联用系统可充分满足β-受体激动剂类兽药残留检测的要求，如表1所示为各兽药的 MRM 参数列表，其中给出了碎裂电压参考值。6495的新型预四极杆离子传输聚焦技术、弯曲锥形碰撞池、以及高能电子倍增管检测器设计，可以大大提高离子的聚焦传输，产生更有效的离子碎片和更高的离子/电子转化率，从而大大提高了检测灵敏度、稳定性及抗污染能力。 采用本文所述方法在浓度范围 0.05-10 ng/mL 内对 18种-受体激动剂类兽药的线性相关性进行讨论。结果表明，所有化合物在此浓度范围内具有良好的线性相关性，相关系数R²均大于0.990，以克伦特罗为例，如图2所示。 图2.克伦特罗标准曲线(0.05-10 ng/mL) 在猪肝基质提取液中添加 0.05 pg/kg 浓度的混合标准溶液，连续进样6针，进行方法稳定性讨论。如图3所示，在低浓度添加水平下18种β-受体激动剂类兽药的峰面积 RSD在0.6%-5.8%之间，完全满足测试的稳定性要求。 图3.0.05 pg/kg 添加浓度下连续进样6针所得 TIC叠加色谱图 对于动物源性食品中β-受体激动剂类兽药残留的分析，需要注意的是内脏类样品需要采用蛋白酶酶解后，通过液液萃取，再经阳离子交交固相萃取柱(PCX)净化后，才能进行LC/QQQ测定。采用同位素内标添加校正可以提高定量的准确度。对于动物肌肉组织或饲料等样本可以不采用酶解处理，直接溶剂提取后经SPE 净化后测试。本文所述方法适用于肌肉组织、内脏、尿液和饲料等样品中β-受体激动剂类兽药的测试分析。 结论 采用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统/6495三重四极杆液质联用系统成功实现了对动物源性食品中多种β-受体激动剂类禁用兽药残留的高灵敏、快速、稳定的定量分析。本方法以国内发布的检测标准为依据，方法学各项参数完全满足或高于标准检测要求，并可应用于各类动物源性样品基质中β-受体激动剂类药物的快速检测。 ( 参考文献 ) ( 1. 中华人民共和国农业部公告第193号：食品动物禁用的兽 药及其它化合物清单 ) ( 2. 中华人民共和国农业部公告235号：动物性食品中兽药最高残留限量 ) ( 3. 中华人民共和国农业部公告560号：兽药地方标准废止目录 ) ( 4. GB/T 22286-2008动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法 ) ( 5. GB/T 21313-2007 动物源性食品中β-受体激动剂残留检测方 法液相色谱-质谱/质谱法 ) ( 6. 农业部1025号公告-18-2008动物源性食品中β-受体激动剂 残留检测液相色谱-串联质谱法 ) ( 7. 农业部1029 号公告-1-2011饲料中16种β-受体激动剂的测 定液相色谱-串联质谱法 ) ( 8. 农业部1063号公告-3-2008动物尿液中11种受体激动剂 的检测液相色谱-串联质谱法 ) ( 9. SN/T 1924-2011 进出口动物源食品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法 ) 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。 @安捷伦科技(中国)有限公司，2016 2016年08月06日，中国印刷 5991-7204CHCN Agilent Technologies     本文采用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统/6495 三重四极杆液质联用系统，建立了同时检测动物源性食品中 18 种 -受体激动剂类兽药（包括克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇等）的分析方法。该方法在 0.05-10 ng/mL 浓度范围内线性相关性良好，相关系数 R2  0.990；在添加浓度 0.05 μg/kg 下，各化合物峰面积稳定性在 0.6%-5.8% 之间；各化合物定量下限均可达到 0.05 g/kg。通过对方法灵敏度、精密度和线性范围等方法学参数进行考察，得到所建立的方法能在15 min 内对动物源性食品中 18 种 -受体激动剂类目标化合物完成快速、高灵敏度的检测分析，完全满足法规监测要求。    瘦肉精主要是指肾上腺素类药物，又称 -受体激动剂 (-agonist)，用于治疗支气管哮喘、慢性支气管炎和肺气肿等疾病。瘦肉精添加在饲料中可以促进动物的快速增长、减少脂肪含量、提高瘦肉率，但其在肉制品中的残留会对消费者的身体健康造成损害。鉴于“瘦肉精”对消费者的潜在危害性，农业部 1997 年发文禁止瘦肉精在饲料和畜牧生产中使用，2001 年和 2002 年，农业部分别下发文件禁止食品动物使用 -激动剂类药物作为饲料添加剂（农业部 176 号、193 号公告、235 号公告、560 号公告、1519 号条例）[1-3]。近年来，在畜产品中非法使用瘦肉精的食品安全事件仍然频发，如双汇瘦肉精事件、浙江毒饲料事件等等。目前各级农产品、食品安全监管部门不断加大监督检查力度，以确保消费者的健康与安全。