全血中尿酸检测方案(电化学工作站)

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第26卷第1期2007年1月分析试验室Chinese Journal of Analysis LaboratoryVol.26.No.12007-1 活化玻碳电极直接测定全血中的尿酸 王长芹，徐海红，韩晓刚，吴守国，*1 (1.中国科学技术大学化学系，合肥230026；2.合肥市第三人民医院检验科，合肥230022) 摘 要：用阳极极化法在碱性溶液中活化玻碳电极，研究了尿酸(UA)在活化玻碳电极(AGCE)上的电化学行为，并提出一种利用微分脉冲伏安技术测定全血中尿酸的电化学分析方法。在0.1 mol，L的乙酸缓冲溶液中(pH5.0)，以0.1mol/L KC作为支持解解质，尿酸在AGCE 上于0.484V处产生一个灵敏的氧化峰。微分脉冲伏安法测定其氧化峰电流与 UA 的浓度在5.0×106~2.0×104molL范围内呈良好的线性关系，相关系数为0.9989，检出限为1.0×10°mol/L 。该方法操作简便，重现性较好，能在抗坏血酸存在下同时测定UA。用于人血中UA的测定。 关键词：活化玻碳电极；尿酸；血；循环伏安法；微分脉冲伏安法 中图分类号：0657.1 文献标识码：A 文章编号：1000-0720(2007)01-027-05 尿酸(UA)是人体内嘌呤的代谢终产物，人体血液中尿酸酸量过高(称为高尿酸症或 Lesch-Nyhan综合症)是许多疾病的征兆，如心血管疾病、痛风、肥胖、糖尿病、高胆固醇、高血压、肾病、心脏病等1~6]。因此，对人体体液中UA 的定量分析在药物控制及临床诊断等方面具有重要意义。 目前检测尿酸的方法有光谱法、色谱法、酶方法19，10、电化学法111，161等。光谱法易受样品中存在的其它发色团的干扰；色谱法需要多步的样品处理过程；酶方法虽然选择性好，但价格昂贵，限制了它的使用范围。电化学法具有高灵敏度、低成本等优点。近年来化学修饰电极法测定UA引起人们极大兴趣，例如，利用去甲肾上腺素-环糊精112]、普鲁士蓝31、聚结晶紫14]修饰玻碳电极，硫醇自组装膜修饰金电极1，纳米金修饰钢锡氧化物电极等选择性测定尿酸。这类修饰电极经常需要较繁琐的处理过程，而且重现性及电极稳定性较差，很难用于实际样品的测定。也有文献报道，用HSO活化的玻碳电极测定UA；用高度氧化的玻碳电极同时测定UA 和抗 ( * 收稿日期：2006-01-16；修订日期：2006-03-27 ) 坏血酸(AA)118；用活化铅电极在多巴胺存在时测定 UA；用丝网印刷的碳电极测定全血中的UA[201等。 本文采采1mol/L NaOH 溶液作为活化剂，用阳极极化法活化玻碳电极，使玻碳电极表面的结构发生变化，并使电极表面富含新鲜碳原子。与裸玻碳电极相比，该电极对UA的氧化具有良好的电催化作用，提高了测定UA的灵敏度，线性范围较宽，能在AA 存在时测定UA。利用活化的玻碳电极直接测定全血中的尿酸，样品不需经过任何处理步骤。 实验部分 1.1 仪器与试剂 LK98B Ⅱ微机电化学分析系统(天津兰力科公司)； PHS-3C数字酸度计(杭州东星仪器设备厂)；三电极系统：玻碳电极(中3mm)为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为辅助电极。尿酸(上海化学试剂公司)；抗坏血酸(上海化学试剂公司)；乙酸和乙酸钠配成pH 5.0的乙酸缓冲溶液，0.1 ml/L KCl 作为支持电解质。所用试剂均 ( 基金项目：国家自然科学基金 (29975025)项目资助 ) ( 作者简介：吴吴国(1958-)，男，副教授 ) 为分析纯，水为二次蒸馏水。 1.2 活化电极的制备 将玻碳电极(GCE)在金相砂纸上抛光成镜面，用水冲洗干净，然后依次在(1+1) HNO3、水中超声清洗5 min 。然后置于1 mol/L NaOH溶液中，用阳极极化法在电位2.2V处活化600s，取出，用水冲洗干净即可用于测定。 1.3 实验参数设置 实验方法选用线性扫描伏安法、循环伏安法和微分脉冲伏安法。线性扫描伏安法和循环伏安法：初始电位0.2V，终止电位0.8V。微分脉冲伏安法：初始电位0V终终电位0.8V，电位增量0.005Ⅴ，脉冲幅度0.05V，脉冲宽度0.05s，脉冲间隔0.1s。 2 结果与讨论 2.1 尿酸在活化玻碳电极上的伏安特性 图1是在0.1mol/L， pH 5.0的乙酸缓冲液中UA(1.0 ×10“mol/L)分别在裸电极和活化电极上的循环伏安图。由图可见，UA在裸电极和活化电极上的氧化是不可逆的。在裸电极上的氧化峰很小，而在1mol/L NaOH溶液中于2.2V下阳极极化的活化玻碳电极(AGCE)上，则在0.484V处出现一较强氧化峰。UA 在 AGCE 上的的氧化电位比在裸电极上降低了20mV，氧化峰电流增大7倍多。结果表明，活化玻碳电极能够提高UA的电子交换反应速度，具有明显的催化作用。循环伏安图上出现了微弱的还原峰，说明活化玻碳电极提高了UA电极反应的可逆性。可能的原因是，玻碳电极活化时，使玻碳电极表面结构发生变化，暴露出新鲜的电极表面，新鲜的碳原子作为活性中心催化了UA 和电极之间的电子交换反应，提高了电极反应的灵敏度和可逆性”Y 2.2 电极活化条件的选择 图2为1.0×10 mol/L的 UA (pH 5.0 HAc-NaAc 缓冲溶液中)在裸电极(GCE)和不同活化剂活化的玻碳电极(AGCE)上的微分脉冲伏安图。分别用1 mol/L NaOH、0.5 mol/L H SO4、1 mol/LHAc、0.1 mol/LH PO4缓冲溶液(pH7.0)活化电极。结果表明，经NaOH溶液电化学活化处理的玻碳电极对UA的氧化峰电流有显著的增大作用(见图1)。故选择NaOH 为活化剂。对电极活化电位和活化时间进行实验，当电极在2.2V阳极极化600 s时，UA 在活化电极上的峰电流最大。因此，活化电极时，将电极置于1 ml/L NaOH溶液中，在2.2V处阳极极化600 s. 图1 在0. 1 mol/L，pH 5.0的乙酸缓冲液中 UA (1.0 ×10~ mol/L)在裸电极(1)和活化电极(2)上的循环伏安图 Fig.1 Cyclic voltammogra ms of UA (1.0×10" mol/L) at aGCE (1) and an AGCE (2) in 0.1 mol/L， pH5.0 acetate buffer solution 图2 在0.1 mol/L， pH5.0的乙酸缓冲液中 UA (1.0 ×10mol/L) 在裸电极(1)和活化电极(2-5)上的微分脉冲伏安图 Fig.2 Differential pulse voltammogra ms of UA (1.0 ×10"mol/L) at the GCE (1) and the AGCE(2-5) in 0.1mol/L，pH5.0 acetate buffer solution 活化液分别为：1mol/L乙酸，0.5 mol/L H SO4， 1 mol/LNaOH和0.1 mol/L H PO4缓冲溶液(pH7.0) 2.3 扫描速度对峰电流和峰电位的影响 用线性扫描伏安法研究了峰电流和峰电位与扫描速度的关系。随着扫描速度的增大，UA的氧化峰电位正移，峰电流增大。UA的氧化峰电流与扫描速度的平方根在50~300 mV/s范围内呈现良 好的线性关系，拟合的线性方程为I=1.74+1.04v(Ipa： A， v： mV/s)， r=0.9987。表明UA的氧化电流是典型的扩散电流。 2.4 底液pH对尿酸氧化的影响及电极过程探讨 底液pH不仅改变UA的氧化峰电流，而且改变其峰电位。在pH3.5~5.0的乙酸缓冲溶液中，浓度为1.0 ×10 mol/L的UA的氧化峰电流随pH的增大而增大；pH>5.0时，随pH增大，峰电流减小。因此本实验选择缓冲液的pH 5.0。峰电位 值E，随溶液pH的增大而呈线性降低，拟合的线性方程为：E=-57.6 ×10 pH+0.77，r=0.9976)，表明有质子参与氧化过程。由于E-pH斜率为-57.6mV/pH，说明反应过程中质子数和电子数相等。我们知道UA 的氧化是两电子转移过程，因此参与电极过程的质子数也是2。o一般来说，水溶液中UA 氧化的主要产物是尿囊素，可能的反应方程式为[22]. 尿酸是芳香族双质子分子，它的pKa值分别为4.17和11.57。在pH5.0时，UA 去质子化形成阴离子。另一方面，由于电极在高氧化电位活化，电极表面含有的氧化功能基团增加。随pH增大，氧化功能基团在AGCE 上去质子化产生负电荷，去质子化的UA 和电极之间发生静电排斥，使UA到达电极表面较困难，致使氧化峰电流降低。 2.5 电极活性与电极使用时间的关系 用循环伏安法研究了电极活性与时间的关系。图3为1.0×10“ mol/L 的 UA(0. 1 mol/L ， pH5.0的醋酸缓冲液)在 AGCE 上的峰电流与时间的关系图。由图可见，随着时间的延长，电极活性下降。2h后，电及活性下降缓慢，6h后，电极活性基本不变。因此，实验中电极活化后紧接着进行测定。 图3 峰电流与时间的关系 Fig.3 Dependence of the peak current on time 2.6 电极的重复性和重现性 表1为1.0 ×10mol/L的UA 在 AGCE 上的 重复性和重现性测定结果(底液为0.1 mol/L，pH5.0的醋酸缓冲溶液)。活化玻碳电极在同一份溶液中用循环伏安法连续测定10次，峰电位值变化为0.477~0.482V，峰电流的平均值为7.89 uA，最大相对误差是4.05%，相对标准偏差(RSD)为2.1%，表明电极的重复性较好。用同一份UA 溶液，玻碳电极重复活化，每次活化后用循环伏安法测定溶液，10次测定的结果见表1。峰电位值变化为0.471~0.481Ⅴ，峰电流的平均值为7.72uA，最大相对误差是5.09%， RSD 为3.2%，表明活化玻碳电极具有较好的重现性。 表1 重复性和重现性测定结果 Tab. 1 Results for repeatability and reproducibility at theAGCE 重复性 重现性 序号 峰电位 峰电流 峰电位 峰电流 E/V I/uA E/V I/uA 1 0.479 8.21 0.478 7.89 2 0.477 7.99 0.476 7.49 3 0.477 8.01 0.479 7.75 4 0.478 8.00 0.479 7.58 5 0.478 7.87 0.471 7.31 6 0.478 7.82 0.471 7.77 7 0.482 7.83 0.472 7.88 8 0.477 7.76 0.472 7.77 9 0.477 7.72 0.480 7.57 0.482 7.66 0.481 8.18 2.7 线性范围和检出限 为了得到较好的灵敏度，选择微分脉冲伏安法对UA进行定量测定。UA的氧化峰电流与其浓度在5.0×10~2.0 ×10mol/L范围内呈良好的线性关系，线性方程I，=4.03+0.103c(I：A，c： umol/L)，r=0.9989，检出为为1.0×10mol/L。同样，在pH5.0的乙酸缓冲溶液中，对1.0X10mol/L的UA进行平行测定10次， RSD 为3.6%。表明重现性较好，可以用于实际样品的定量分析。 2.8 尿酸和抗坏血酸的同时测定 图4为在pH5.0的醋酸缓冲液中UA (1.0 ×10mol/L)和 AA (1.0×10mol/L)在 AGCE 上的微分脉冲伏安图。我们知道，UA 和AA的氧化电位很接近，因此AA是UA伏安测定的主要干扰物质。在裸电极上，UA和AA不能分开。在活化玻碳电极上，UA和AA能很好地分开(见图4)，而且与两者单独测定时峰形基本一致。实验发现，在活化玻碳电极上，AA的氧化电位比UA 低约250mV，因此用 AGCE 可以同时测定UA 和AA。 图4 醋酸缓冲液中 UA (1.0 ×10 mol/L) 和 AA(1.0 ×10ml/L)在 AGCE 上的微分脉冲伏安图 Fig.4 Differential pulse voltammograms of UA(1.0 ×10"mol/L) and AA (1.0×10mol/L) at the AGCE in0.1mol/L， pH5.0 acetate buffer solution 2.9 样品分析 取人体全血3份，用微量移液管移取500 L血样于25 mL 容量瓶中，加入pH5.0的乙酸缓冲溶液稀释并定容，用微分脉冲伏安法按2.3实验参数进行测定，结果列于表2。 表2 人体全血中尿酸的测定结果(n=5) Tab.2 Determination results of uric acid in human serumsamples 样品 UA则定值 RSD 回收率 编号 c/(umol/L) /% /% 7.37 3.84 101.4 2 5.75 4.40 99.8 3 5.85 2.54 97.4 3 结论 研究结果表明，活化玻碳电极能明显增大尿酸的氧化电流，使氧化电位负移。说明活化玻碳电极对尿酸的电化学氧化具有明显的催化作用。玻碳电极通过在强碱性溶液中阳极极化进行活化，操作简单方便，重现性较好。在活化的玻碳电极上，尿酸和抗坏血酸的氧化峰分离良好，既可用于尿酸和抗坏血酸同时测定，亦可在抗坏血酸存在下选择性测定尿酸。该法用于人血样品中尿酸的测定，样品不需经过任何处理步骤，即可得到满意的分析结果，为生物样品中尿酸的测定提供了一种快速可靠的分析方法。 ( 参考文献 ) ( [1 ] Wootton I D P， F r eeman H . 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Chemical Examination Section， The Third People’s Hospital ofHefei， Hefei 230022) ， Fenxi Shiyanshi， 2007，26(1)：27~31 Abstract： An activated glassy carbon electrode (AGCE) was generated by anodic polarization in the alkali solution.The electrochemical behavior of uric acid (UA) was investigated at the AGCE by cyclic voltammetry (CV) and linearsweep voltammetry (LSV). A novel method was proposed for the determination of UA in human whole blood by differ-ential pulse voltammetry (DPV). A sensitive oxidation peak was observed at 0.484 V (w. SCE) in 0.1 mol/L HAc- NaAc buffer solution (pH 5.0) with 0.1 mol/L potassium chloride as supporting electrolyte. The peak current iswell-proportional to the concentration of UA over the rang from 5.0 ×10to 2.0 ×10 mol/L by DPV， with the correlation coefficient of 0.9989. The activated glassy carbon electrode is easy to be prepared with good reproducibilityand it can be used for the determination of UA in the presence of ascorbic acid. The method was employed for mea-surement of UA in human whole blood with satisfactory results. Key words ： Activated glassy carbon electrode； Uric acid； Blood； Cyclic voltammetry ； Differential pulse voltammetry —China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net