小麦中真菌毒素检测方案(液相色谱仪)

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聚焦食品安全定量分析 利用高分辨质谱QExactive Focus定量分析小麦和饲料中的真菌毒素 真菌毒素是真菌在食品或饲料里生长所产生的代谢产物，对人和动物都具有极大的健康隐患。据联合国粮农组织(FAO)统计，全球每年约有25%的农产品受到真菌毒素污染。为了保证食品和饲料的安全，全世界多个国家通过法规或标准严格规定粮食中主要真菌毒素的限量。但传统的检测方法存在耗时长，通量低，定性能力差等问题。本文采用高分辨台式质谱仪QExactive Focus建立了粮食提取物中多种真菌毒素的检测方法。方法具有媲美高端三重四极杆的灵敏度，同时可以对复杂基质中的痕量物质准确地定性分析，充分保障结果的准确性。 实验方法 液相色谱方法 UHPLC： Thermo Scientific Ultimate 3000 RSLC 色谱柱： Thermo Scientific Hypersil Gold (50*2.1mm， 1.9pm)流速：0.3mL/min，进样体积： 5pL 流动相：A相：2mM的甲酸铵和20 uL/L的甲酸水溶液 B相：2mM的甲酸铵和20 uL/L的甲酸甲醇溶液 梯度洗脱： Time (min) %A %B 0 98 2 2 55 45 6 2 98 11 2 98 11.5 98 2 14 98 2 质谱仪： Thermo Scientific Q Exactive Focus 台式高分辨质谱仪。实验采用正负切换 Full MS-ddMS²扫描方式进行筛查分析，采用正离子或负离子模式的 Full MS-ddMS²和 t-SIM-ddMS²进行 定量分析，如图1所示。利用数据依赖扫描获得的二级子离子碎片离子信息进行确证。 Full MS：分辨率为70，000(FMHW@m/z 200)。 t-SIM：分辨率为70，000(FMHW@m/z 200)， isolation width为4m/z MS/MS采集：L： 17，500(FMHW@m/z 200)分辨率下数据依赖采集； HCD NCE 为 45%， isolation width 为 4m/z 图1.扫描方法设置， a)快速正负切换的筛查方法； b)Full MS 定量方法； c) t-SIM定量方法 样品前处理方法 样品前处理方法 参考文献[1]，样品经1%的甲酸乙腈/水溶液浸提 15min 后，再震摇1h后，离心，过滤，供测定分析。 实验与讨论 筛查结果分析 在一定的 Mass tolerance下，采用化合物加合离子峰的精确质量数从 Fullscan 的数据中提取，得到 XIC 图谱。Q ExactiveFocus 具有良好的质量精度，因此可以将提取窗口缩小至5ppm，甚至更低，充分保证了方法极高的选择性。同时，QExactive Focus 可以实现快速的正负离子切换扫描，并在正负切换的模式下保证高质量精度，在提高筛查实验通量同时，也保证结果的准确(图3)。 图2.正负切换扫描模式下的筛查分析结果 定量结果分析 本文分别采用了 Full MS-ddMS²和 t-SIM-ddMS²两种方式进行定量分析。结果表明(见表1)， t-SIM由于发挥了四极杆的离子筛选作用，可以获得更宽的线性范围和更高的灵敏度(见图3)，在小麦提取物基质中的 LOD 较 Full MS有2-20倍的提升。 目前采用高端的三重四极杆质谱对基质中黄曲霉毒素B1 测定的LOQ 为 200ppt 左右，本实验的测定结果表明 Q ExactiveFocus 的 Full MS 和 t-SIM 两种定量模式均具有媲美高端三重四极杆的灵敏度。 Compound Name Elemental Composition Polarity Exact Mass[M+H]+ LOD Full MS[ppb] LOD SIM[ppb] Factor Aflatoxin B1 C17H1206C17H1207 + 313.0707329.0656 0.13 0.07 2 Afloatoxin G1 0.07 0.016 4 Citreoviridin C23H3006 + 403.2115 5.33 2.67 2 Citrinin C13H1405 251.0914 8 0.4 20 Deoxynivalenol (DON) C15H2006 + 297.1333 26.7 1.33 20 DON-15-acetyl C17H2207 + 425.217 53.33 10.67 5 HT-2 Toxin C22H3208 325.0707 2.67 0.27 10 Sterigmatocystine C18H1206 467.2276 0.53 0.05 10 T2 Toxin C24H3409 + 403.212 1.33 0.27 5 表1.小麦提取物中真菌毒素的定量结果比较 图3. Aflatoxin B1( 黄曲霉毒素B1 ) 和 Citrinin(橘霉素)小麦提取物基质加标的标准曲线和不同浓度水平的 SIM 扫描色谱图 实验在采集一级扫描数据的同时，也可由方法设置中的inclusion list 来触发数据依赖扫描，获得二级子离子的全扫描图谱，并以此对结果进行确证分析。方法还可通过 top N 和动态排除，来保证低含量组分的检测和定量分析足够扫描点数的采集。图4为二级数据的确证结果。 图 4. HRAM ddMS²扫描确证小麦提取物中不同类型的黄曲霉毒素 本文建立了运用高分辨质谱对粮食中真菌毒素的筛查和定量方法。Q Exactive Focus 凭借其高达70，000( FMHW@m/z200)的分辨率和良好的质量精度可以很好的排除复杂基质中的干扰，实现方法的高特异性；凭借其快速的正负极性切换能力，可在一针分析内同时完成对正负离子的检测，实现方法的高通量，在实现高灵敏度的同时，还能通过数据依赖的二级全扫描对结果进行确证，可以很好满足食品安全的定量分析需求。 ( 参考文献 ) ( [1] KELLMANN ET AL “ F ull Scan M S in C o mprehensiveQuanlitative and Quantitative Residue Analysis in Food andFeed M atrices： How Much Resolving P ower is required?” J Am Soc M ass Spectrom 2009，20，1464-1476 ) SCIENTIFIC 赛默飞世尔科技(中国)有限公司免费服务热线： 支持手机用户)SCIENTIFIC客服邮箱： sales.china@thermofisher.com