猕猴毛发中毛发皮质醇提纯方法检测方案(研磨机)

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动 物 学 研 究 2009， Aug.30(4)：401-405CN53-1040/QQISSN 0254-5853DOI： 10.3724/SP.J.1141.2009.04401Zoological Research 动 物 学 研 究30卷402 猕猴毛发皮质醇测量方法探索 1，2，3 1，2，3 1，2，3 1，2，3 2 2. 1，*李春禄 秦冬冬 冯晓丽 ，5张 波 杨上川，胡新天，马原野 (1.中国科学院昆明动物研究所灵长类认知实验室，动物模型和人类疾病机理重点实验室，云南昆明650223； 2. 中国科学院昆明动物研究所灵长类感觉、运动及整合实验室，动物模型和人类疾病机理重点实验室，云南昆明 650223：3.中国科学院研究生院，北京 100049) 摘要：毛发是评估下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)慢性活性变化很好的样品，毛发皮质醇的提取方法非常重要。为保证毛发皮质醇提取过程的可靠性，实验使用了液了冷冻研磨；设计了空白对照组(磷酸缓冲液(PBS))(n=3)、原管组(n=10)和新管组(n=10)，以检验缓冲液、离心管对提取的潜在干扰；对同一动物样品(n=16)两次独立提取的结果及毛发皮质醇浓度与受到的极端攻击量(血浆皮质醇浓度的间接指标)(n=16)进行了Pearson相关分析。结果表明：空白对照组测量结果为Opg/mg；新管浓度值与原斤无显著性差异(Fq，19)=0.041， P=0.843， one-wayANOVA)； 两次独立提取结果高度正相关(r=0.893， P=0.000)；皮质醇浓度与受到的极端攻击量中度正相关(r=0.591， P=0.008)。因此，离心管、缓冲液对实验没有显著性干扰，溶液中皮质醇来源于毛发样品；提取操作流程可靠，所得数据可信。 关键词：猕猴；毛发；皮质醇；提取 中图分类号：Q959.848； Q513 文献标识码： A 文章编号：0254-5853-(2009)04-0401-05 AReliable Procedure for Measuring Cortisol Levels inRhesus Macaque Hair Samples LI Chun-lu123， QIN Dong-dong2， FENG Xiao-li23， Zhang Bol23，YANG Shang-chuan， HU Xin-tian， MA Yuan-ye (1. Laboratory of Primate Cognitive Neuroscience Research and Key Laboratory of Animal Models and Human Disease Mechanisms， Kunming Instituteof Zoology， the Chinese Academy of Sciences， Kunming 650223， China； 2. Laboratory of Sensory-motor Integration Research and Key Laboratoryof Animal Models and Human Disease Mechanisms， Kunming Institute of Zoology， the Chinese Academy of Sciences， Kunmingg650223， China； 3. Graduate School of the Chinese Academy ofSciences， Beijing 100049 Abstract： Hair provides a suitable sample inassessing long-term changes in hypothalamic-pituitary-adrenocorticalaxis (HPA) system activity. The procedure used for hair analysis is therefore very important. To ensure that our procedureis reliable， liquid nitrogen was used to deepfreeze the samples before powdering them. Experimental trials used threetreatment types： blank group (phosphate buffered saline (PBS)) (n=3)， old tube group (n=10) and new tube group (n=10).The potential effects of PBS and tubes was then investigated.Additionally，，both the relationship between the results oftwo samples of the same individuals (n=16) yielded by the same procedures but at different times， and the relationshipbetween hair cortisol concentrations and the number of received intense aggressions (n=16) were also investigated. Theresults showed that the cortisol concentration of the blank group was 0pg/mg； new tubes did not differ from old tubes (F(1，19)=0.041，P=0.843， one-way ANOVA)； and there was a high association between the results of two samples of thesame individuals， yielded by same procedures operated at different times (r=0.893， P=0.000). Moreover， hair cortisolconcentrations were moderately correlated with the number of received intense aggressions (r-0.591， P=0.008). Therefore， PBS and tubes did not affect the results significantly， therefore， our procedure was deemed reliable. ( Key words：Rh e sus Macaque； Hair； Cor t isol； Ex t ract ) ( 收稿日期：20 0 9-05-01；接受日期：2009-07-07 ) ( 基 金项目：86 3 计划(2 0 0 6 AA02A116)；国家自然 科 学基金 (306706 6 9；30770 7 00；3087 0 825) ) ( 通讯作者 (C o rr e sponding author)， E-mai l ： Tel： 0086-871-5193083， E-mail： yuanma0716@vip.sina.com； xthu @ mail.kiz.ac.cn ) ( 第一作 者 简介： E-ma i l： liguan1980@163.com ) 糖皮质激素是一种应激激素，可以调节糖、蛋白质和脂肪的代谢，提高机体对伤害性刺激的抵抗力，在动物生存中起到了相当重要的作用。皮质醇是人类和非人灵长类糖皮质激素的主要成分(Davenport et al， 2006)。因此，皮质醇通常用作衡量动物受到的应激刺激的大小的指标(Stavisky etal， 2001)。测量时样品一般使用血清或者血浆，但是这种样品对研究应激的实验来说却存在许多问题，例如：取样过程中的捕捉、麻醉、取样前是否进食、取样前短时间内环境变化引起的躁动(Puri etal， 1981； Creel et al，1992； Davenport et al， 2006)及皮质醇的昼夜节律变化(Rose et al，1978； Plant，1981； Umberkoman-Wiita et al，1981)都会对动物的应激实验造成干扰。在动作敏捷、个体较大的群养动物应激研究中，问题更为突出：如多次采血带来的动物福利问题；；由于不能在短时间内捕捉到动物，捕捉时目标动物和同笼的其他动物所受到的应激影响；多次重复捕捉给动物带来的影响(Creel，2001)。这些问题都可能会影响应激相关研究实验数据的可信性(Creel， 2001)，阻碍了个体较大的群养动物(如猕猴—―厂种非常好的人类疾病研究模型)的应激研究。因此，取样技术的选择在应激研究中显得尤其重要。 为了避免这些问题，毛发样品是一种很好的选择，血液里的物质可以通过毛细血管渗透到毛囊细胞，最后扩散到毛发里(Cone， 1996)。因此，从毛发中可以提取出皮质醇。毛发样品有许多独特的优点： (1)毛发中的皮质醇是数周，甚至数月的积累总和，不会受到昼夜节律的影响； (2)可以避免取样过程中捕捉、麻醉和其他因素带来的应激干扰，动物捕捉次数也明显减少； (3)毛发易采集、安全、方便储存和运输(Koren et al， 2002)。因此，近两年国外已经有少量实验室将毛发皮质醇应用于人和猕猴的相关研究，并证实毛发分析是很好的评估下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)系统慢性活性变化的工具(Davenport et al， 2006； Kalra et al， 2007；Yamada et al，2007)。然而，国内还没有类似实验的报道。我们利用实验室现有条件，在猕猴上对这种方法进行了探索和改进，希望能给国内研究者提供参考，推动国内的相关研究。 材料和方法 1.1 实验动物 实验使用的16只成年雄性猕猴(Macacamulatta)，年龄在7到19岁之间，生活在3个3mx5mx3m 猴笼中 (n=4，5，，7)。动物饲养在中科院昆明动物研究所灵长类研究中心。除标准猴粮外，每天投喂水果或者蔬菜，自由饮水。实验时，动物均已经生活在各自笼内至少5个月。 1.2 行为观察 有研究表明：猕猴受到的极端攻击量可以预测血浆皮质醇的水平，它们具有正相关性(Gustet al，1993)。因此，我们对动物进行了行为观察，用受到的极端攻击量作为血浆皮质醇水平的一个衡量指标。实验使用了追踪取样和行为取样(local samplingand behavior sampling)两种方法记录动物行为并进行了录像。每天观察时间为：上午8：40-9：40；9：50一10：50： 下午 14：30-15：30；15：40-16：40；每只动物一天观察2h，共观察6h。16只动物共观察了96 h。实验中记录了极端攻击行为：咬、抓、打 (Shively et al， 2006)。 1.3 取样过程 15：00—16：00期间，将动物捕捉住后，肌肉注射氯胺安(15mg/kg)麻醉，之后将动物移出笼子。小心地用理毛器采集颈部后顶区的毛发，约5cm²。用铝箔将毛发包好，避免污染。 1.4 毛发清洗和提取过程 Davenport等(2006)对样品清洗过程做了详尽研究，我们就采用他们的清洗方法(Davenport et al，2006)。样品粉碎是提取毛发皮质醇非常关键的一步，从相关文献中可以发现他们对这-一步骤的改进：起初为剪碎(Koren et al， 2002)， 后来两个实验室使用了德国莱驰MM200进行研磨粉碎(Raul etal， 2004； Davenport et al， 2006)。我们使用了德国莱驰MM400， 并在文献基础上做了一定改进：将样品放入液氮内充分冷冻变脆后，再进行研磨，这样既可以使研磨粉末更细、更均匀，又可以避免研磨过程中局部高温对样品造成的影响。参考多个文献后，我们最终选择了甲醇(Koren et al， 2002；Davenport et al， 2006； Kalra et al， 2007； Yamada etal， 2007)，作为提取试剂，其具体操作步骤：：(1)称取 500mg毛发样品置于15mL玻璃试管中，加入10mL异丙醇。在室温下将该试管放于调速多用振荡器上洗涤3min(频率100次/min)，共洗涤2次；洗涤后的样品置于电热恒温干燥箱内，37℃干燥8h。(2)干燥后将样品放入80mL小烧杯内，用手术 剪剪碎。之后放入25mL不锈钢研磨罐内(内有15mm不锈钢研磨球一个)，拧紧后将罐放入液氮内冷冻至液氮停止沸腾。将研磨罐装入冷冻混合型球磨仪MM400， 研磨 2.5 min (频率26Hz)。(3)称取400mg毛发粉末，置于10mL离心管内，并加入8mL甲醇。室温下，将离心管置于振荡器，振荡24h(频率230次/min)， 提取皮质醇。(4)将离心管离心5min (离心力12000g，)，取4mL上清液移入5mL离心管内。(5)在5mL离心管内取2mL上清液放入2mL离心管，室温用氮气流进行干燥，样品干燥后，加入5mL离心管内的剩余样品，继续干燥(随着甲醇的挥发，离心管内出现悬浮物。我们对这些悬浮物进行了研究)。(6)干燥后加入0.5mL PBS(磷酸缓冲液： NaCl 8g， KCl 0.2g， Naz HPO4 1.44g，KHzPO4 0.24g， 加去离子水定容至1L， 将pH值调整到7.4)对样品进行重构。振荡昆匀后，放入-20℃冰箱内储存至检测日。 1.5放免检测 实验应用了美国进口Cortisol RIA DSL-2000 试剂盒，这种试剂盒主要用于血清、血浆和尿液皮质醇的定量测量。我们使用了昆明医学院第二附属医院自动放免仪，按照试剂盒说明书进行了放免检测。检验前将所有试剂在室温下平衡，并充分混匀。检验步骤如下：(1)标记T管、标准品管、质控品管和样品管，并按次序排列好；(2)向相应管内加入 25uL标准品、质控品、样品；(3)向所有管内加入 500pL[r-125]；(4)彻底混匀抗血清，向除总T管外的所有管内加入500pL抗血清；(5)混匀，37℃水浴锅内温育 45 min；(6)将标准品管、质控品管和样品管低温离心(1500g) 15min； (7)将除总T管外的所有管上清液吸干；(8)放入自动放免仪计数，并计算结果。为了数据统计需要，我们将数据单位从ug/dL转换成了pg/mg。 1.6 实验设计 (1)为排除离心管和 PBS(磷酸缓冲液)带来的假阳性，我们将 0.5 mLPBS 放入离心管进行了放免检测(n=3)。(2)离心管壁可能会吸附皮质醇，对皮质醇浓度测量造成影响，为检测这种影响，我们将重构后的样品的1/2移入新管，如果有吸附作用，则新管(n=10)中样品由于经过了两次吸附，皮质醇浓度应低于原管(n=10)。(3)为了检验悬浮物对测量结果是否有影响，我们对同一样品的浊液(n=10)和清液(n=10)进行了比较。(4)为了保证实验操作的可靠性，我们对其中一批样品(n=16)在不同时间进行了两次放免测量。对同一只动物(n=16)的两个样品， 表1实验仪器和试剂 Tab.1]Instrument and agent 仪器 Instrument 型号 Type 生产厂家 试剂Agent 浓度 生产厂家 Manufacturer Concentration Manufacturer 调速多用振荡器 HY-2 江苏天由有限公司；常州 甲醇 99.5 天津市风船化学试剂科技 Cycling shaker 国华电器有限公司 Methanol 有限公司 电热恒温干燥箱 DHG-9011A 上海精宏实验设备有限公司 异丙醇 99.7 天津市风船化学试剂科技 Drying stove Isopropanol 有限公司 冷冻混合型球磨仪 Retsch ball mill MM400 德国莱驰公司 氮气 99.99 昆明天贝气体公司 Nitrogen gas H-1650 离心机 Centrifuge 湘仪离心机仪器 液氮 昆明动物所中心实验室 有限公司 Liquid nitrogen 自动放免仪 皮质醇放免 Automatic GC-1200 中国科大中佳公司 试剂盒 DSL-2000 美国 Diagnostic radioimmunoassay Cortisol RIA Systems Laboratories assembly 2 结 果 实验结果表明， PBS测量结果为 0 pg/mg， 新管浓度 值[(184.25±39.33)pg/mg]与原管[(196.38±45.56)pg/mg]无显著性差异(F(1，19)=0.041， P=0.843，one-way ANOVA)。浊液[(167.50±19.44)pg/mg]与清液(170±21.18)pg/mg]无显著性差异(F(1，19)=0.011，P=0.918， one-way ANOVA)， 因此悬浮物对检测结果没有明显影响。受到的极端攻击量与毛发皮质醇浓度具有中度相关性(r=0.591， P=0.008， Pearsoncorrelation， 图1)。同一样品两次测量结果呈现高度相关性(r=0.939， P=0.000， Pearson correlation， 图2a)。同一动物的两个样品皮质醇浓度也高度相关(r=0.893， P=0.000， Pearson correlation， 图 2b)。更重要的是我们得到的猕猴毛发皮质醇浓度主要集中在50~300pg/mg之间，与猕猴文献数据(32.1~254.3pg/mg)(Davenport et al， 2006)接近。只有一只动物毛发皮质醇浓度超过了 400pg/mg， 但是这只 动物的两个样品浓度值是一致的。因此，这可能是由动物的个体差异造成的。 Number of received intense aggression 1 皮质醇浓度与受到的极端攻击次数相关性散点图 Fig.1Scatter plot illustrating the relationship between haircortisol concentrations and the number of received intense aggressions across individual monkeys (n=16). 图2皮质醇浓度相关性散点图 整个提取过程中，离心管和PBS 并没有对样品造成假阳性。这说明样品皮质醇来源于毛发，而不是污染。离心管壁没有吸附皮质醇，因此不会对数据的可靠性造成影响。重构后样品是一种浊液，难以分离，不过我们实验证明样品里的悬浮物对结果不会造成影响，不需要分离。然而，我们建议检测前将样品混匀。同一样品两次测量的结果，其高度 相关性表明了放免检测操作过程稳定，重复性好，测量结果可信。同一动物两个样品间的高度相关性为我们整个实验操作的可靠性提供了证据，同时也说明同一动物邻近毛发的皮质醇含量高度相关。受到的极端攻击量虽然是血浆中皮质醇浓度的间接指标，但是它与毛发皮质醇浓度的中度相关性，以及我们实验数据与文献数据皮质醇含量范围的一致性(Davenport et al， 2006)， 都说明了我们确实提取到了毛发中的皮质醇，数据可信，同时毛发皮质 醇可以作为衡量应激刺激大小的指标。由我们的经验及测量得到的样品皮质醇含量最低值和试剂盒的灵敏度大致可以推算出：在猕猴毛发皮质醇提取实验中，为得到足够浓度，毛发样品量不宜低于 200mg. 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