富硒保健品中总硒含量检测方案(原子荧光光谱)

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甲苯萃取-微波消解-原子荧光光谱法测定富硒保健品中有机硒和总硒 李四生1 董晓根2 李家涛1 周勤文1 李建伟1 (1.合肥市疾病预防控制中心,合肥　230022; 2.北京市丰台区疾病预防控制中心,北京　100071) 摘 要 目的:建立分离、消解、测定富硒保健品中有机硒和总硒的分析方法。方法:采用甲苯萃取分离样品中的有机硒后,利用HNO3-H2O2消解体系微波消解,原子荧光光谱法测定样品中的有机硒和总硒。结果:在优化工作条件下,硒的检出限为0.088μg/L,相对标准偏差为0.43% ~0.53%,线性范围为0~200μg/L,应用该方法检测不同富硒保健品中的总硒含量为0.87~13.04 mg/kg,有机硒含量为0.76~8.54 mg/kg,总硒加标回收率为95.1% ~106.2%。结论:该方法简便、灵敏、重现性好、干扰少,适合富硒保健品中的有机硒和总硒测定。 关键词 甲苯萃取;微波消解;原子荧光光谱法;富硒保健品;有机硒;总硒 Determination of organic and total selenium contents in selenium-enriched health food by methylbenzene extraction-microwave-assisted digestion-atomic fluorescence spectrometry LiSi-sheng1, DongXiao-gen2, LiJia-tao1, Zhou Qin-wen1, LiJian-wei1 (1·HefeiCentre for Disease Control and Prevention, Hefei230022,China; 2·FengtaiCentre for Disease Control and Prevention, Beijing 100071, China) Abstract Objective: To develop a method for the separation, digestion and determination of organic and total selenium in selenium-enriched health food· Methods: The organic selenium extracted and separated from selenium-enriched health food was digested by a mixture of concentrated nitric acid and hydrogen peroxide(HNO3-H2O2) in the sealed vessel· Then the organic selenium was subjected to the analysis by atomic fluorescence spectrometry(AFS)·Except the methylbenzene extraction, total selenium was digested and measured as same as organic selenium· Results: Under the optimal work condition, the detection limit of selenium by this method was 0.088μg/L, the linear range 0~200μg//L, the relative standard derivation 0.43% ~0.53%·Thetotal selenium content of 0.87~13.04 mg/kg and the organic selenium contentof0·76~8·54 mg/kg were detected respectively from the selenium enriched health food by this method with the recovery rate of 95.1% ~106.2% for total selenium· Conclusion: This method is proved to be simple, rapid, sensitive accurate and repeatable· So it is suitable to the determination of organic and total selenium in selenium-enriched health food· Key words Methylbenzene extraction; Microwave-assisted digestion; AFS; Selenium-enriched health food; Organic selenium; Total selenium 硒(Se)是人体必需微量元素,在生命过程中起着重要作用,大量基础研究和临床实践证实:当Se摄入量不足时,可诱发心血管疾病、大骨节病、肿瘤、胰腺纤维化、白内障等疾病[1];硒也是一种准金属元素,其形态常分为无机硒和有机硒,有机硒比无机硒具有较高的生物活性(比无机硒约高100倍)和较低的毒性[2],因此,应该重视对富硒保健品中总硒和有机硒含量的测定。为了测定保健品中有机硒的含量,首先应该将无机硒和有机硒分离。目前,分离方法有: Tris-缓冲液-甘油提取法[3],透析处理法[4], XAD树脂吸附法[5]等。采用微波消解样品可以大大减少酸的使用量,降低空白值,缩短消解时间,减少了Se的挥发损失。测定硒的方法有:HG-AAS[6],分光光度法[7],荧光法[8], GC-MS[9]等。实验采用甲苯萃取保健品中有机硒,将提取液中的甲苯在水浴上挥发干后,利用微波消解,用原子荧光光谱法测定有机硒含量;直接利用微波消解样品,用原子荧光光谱法测定总硒含量。该方法具有简便、快速、灵敏、准确、重现性好等特点。 1　材料与方法 1.1　主要仪器 AFS-230E双道原子荧光光度计(北京海光仪器公司),附带断续流动全自动进样器;MARS5微波消解仪(美国CEM公司),附带XP1500Plus密闭消解罐; Se高性能空心阴极灯(北京有色金属研究总院); PHS-3C型酸度计(上海雷磁仪器厂)。 1.2　试剂 实验用水电阻率均为18.2MΩ.CM去离子水,所用玻璃器皿均经硝酸(1+9)浸泡过夜处理,所用酸为优级纯,其他试剂为分析纯。盐酸,硝酸, H2O2( 30% ),氢氧化钠25 mol/L); 15 g/L硼氢化钠(临用现配):取15 g硼氢化钠(NaBH4)溶解于1000 ml 1.25 mol/L氢氧化钠溶液中; Se标准储备液100μg/ml(GSB07-1253)(由国家环境保护总局标准样品研究所研制); 0.3 mol/L铁氰化钾溶液:称取100 g铁氰化钾,溶于去离子水中,定容至100 m,l摇匀。 1.3　方法 1.3.1　有机硒的萃取分离　取样品0.3~0.5 g于烧杯中,加30 ml水搅匀,用5%NaOH溶液调节pH为6.0~7.5。将调好pH的样品溶液倒入100 ml的分液漏斗中,并加入10 ml甲苯,萃取2 min,取有机相。同样方法再萃取一次,将两次有机相溶液合并于密闭消解罐中,沸水浴挥干甲苯。 1.3.2　样品消解　在挥干甲苯的样品消解罐中,加入4 ml硝酸和2 mlH2O2,然后按操作方法消解,微波消解程序分为3步,各步升温时间分别为8, 4, 5 min,控制温度分别为100,120, 160℃,保持时间分别为1, 5, 10 min。消解后,加入6 mol/L盐酸10 ml,沸水浴15 min,将消解液转入25 ml比色管中,用少量水洗涤消解罐3次,并将洗涤液转入比色管中,加入0.3 mol/L铁氰化钾溶液1 m,l用去离子水定容至25 m,l室温反应15 min,混合测定样品中有机硒含量。样品中总硒则不需要进行萃取,直接进行与有机硒测定方法一样消解测定处理。同时做空白对照。 1.3.3　仪器工作条件　仪器工作参数见表1。 表1　仪器工作参数 1.3.4　标准曲线绘制　对Se标准储备液进行一定倍数稀释成5μg/ml Se标准使用液,在6个消解罐中各加入Se标准使用液体积数(ml): 0, 0.20, 0.40, 0.60, 0.80, 1.00,在与样品相同条件下消解处理后加入6 mol/L盐酸10 m,l沸水浴15 min,用少量水洗涤消解罐3次,并将洗涤液转入比色管中,加入0.3 mol/L铁氰化钾溶液1 ml,用去离子水定容至25 ml,各管相当Se浓度分别为0, 40.0, 80.0, 120.0, 160.0,200.0μg/L。参照仪器工作条件,将原子荧光光度计调到最佳状态,首先进入空白值测量状态,连续对第1管测定以获得稳定的空白值自动扣除本底后,再依次测定各标准管(第1管需要再测定1次),以测得荧光强度减去第1管荧光强度与相应的Se浓度(μg/L)绘制标准曲线。 1.3.5　样品测定　用测定标准管的操作条件测定样品和空白对照。在测定样品前,先对第1管连续测定以获得稳定的空白值,再测定2次空白对照,取2次均值作为扣除本底的空白值,然后测定样品,通过标准曲线算出Se含量。 2　结果与讨论 2.1　萃取溶液酸度对萃取效率的影响 硒的有机化合物因溶液酸度不同,在甲苯和水中分配系数也不同,选择合适的酸度,使硒的有机化合物能够最大溶解在甲苯中是提高萃取效率的关键。利用甲苯萃取2次后,在有机相中加入15%的半胱氨酸溶液1 ml,摇匀后静置,加入1~2滴亚甲蓝溶液并开始计时,有机硒使亚甲蓝的褪色时间为5~10 min,无机硒使亚甲蓝的褪色时间为30~60 s。根据褪色时间判断有机相中是否含有无机硒,实验通过选择5.0,5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0 pH值分别进行萃取,分析发现pH为6.0~7.5时,有较好的萃取效率。 2.2　微波消解条件参数的选择 2.2.1　微波消解酸体系的选择及酸试剂用量对消解结果的影响　硫酸因沸点高在敞开式湿消化中经常使用,但是在密闭消解罐中容易产生高温,给消解罐耐热性能提出了更高的要求,因而不适用。而氧化性极强的高氯酸与有机物混合有爆炸危险,在密闭消解罐中也尽可能少使用。实验采用HNO3-H2O2混合消化液消解,试验结果表明,加入4 mlHNO3与2 mlH2O2进行消化样品,能够得到澄清的消化液。为了避免样品在加入消化液反应过于激烈,可先放置10 min后,再进行微波消解。 2.2.2　微波消解功率、时间和温度对消解效果的影响　 消解的目的是将样品中的有机物进行无机化处理,一般以消化液澄清透明作为消化完全的判定依据。CEM仪器可自动调节功率输出,但在设定方法时仍应注意功率平台与容器数目的匹配关系:1-2罐(300W),3-5罐(600W),6罐以上(1200W),并尽量采用功率最小化原则。实验采用梯度升温方式,前期缓慢升温,并且做短暂保持,以便观察消解罐是否有泄漏发生,待反应较为平缓后升温消解。通过反复试验,把微波消解程序分为3步,各步升温时间分别为8,4,5 min,控制温度分别为100, 120, 160℃,保持时间分别为1,5,10 min,能够使样品消化完全。 2.3　NaBH4浓度的选择 NaBH4浓度对Se测定有很大的影响,试验结果如图1, Se分别在浓度为20 g/L时,有较大的荧光强度,当NaBH4浓度大于25 g/L时,因产生氢气过大荧光强度反而减弱,但当NaBH4浓度过低时,荧光强度较弱。实验考虑到信噪比的改善,采用NaBH4浓度为15 g/L,并且溶解在1.25 mol/L氢氧化钠中,以增强NaBH4稳定性, Se得到较高荧光强度。 图1　NaBH4对荧光强度的影响 2.4　仪器条件的选择 2.4.1　光电倍增管负高压及空心阴极灯电流的选择　负高压及灯电流大小选择应考虑两方面的因素,一方面,负高压大,仪器的灵敏度高,但仪器噪声大,灯电流大,激发源的激发强度也大,但过大的电流会缩短灯的使用寿命,有时还会使工作曲线弯曲;另一方面,灯随着使用时间的延长,灵敏度也会逐渐降低,适当增加负高压和灯电流,能够提高灵敏度。实验以灵敏度最优化,仪器噪声最小为前提,反复试验选择负高压为300 V,灯电流为80 mA。 2.4.2原子化器高度的选择　原子化器高度过低,光源射到炉口的反射光过高导致检出限变差,原子化器高度过高,灵敏度和测定的精密度下降。试验选择6, 8, 10 mm 3个高度进行比较分析,结合灵敏度和精密度综合考虑,选择8 mm作为原子化器高度。 2.4.3　载气流量选择　载气流量过大,会使硒化氢浓度降低,使测定灵敏度降低;载气流量过小,不能够把产生的硒化氢完全带到原子化器石英管中,使荧光强度下降。实验选择载气流量为400 ml/min,屏蔽气流量为1000 ml/min。 2.5　反应介质酸度和载流酸度的选择 Se6+必须在盐酸体系中才能够被还原为Se4+,才能够被NaBH4还原生成硒化氢,试验通过加入6 mol/L盐酸10 ml在沸水浴加热15 min,使Se6+还原为Se4+。盐酸的浓度对Se的荧光强度有很大的影响,试验结果如图2,当Se在低于5%盐酸介质中,荧光强度很弱,当盐酸浓度大于20%,能够得到较稳定的荧光强度。实验通过加入6 mol/L盐酸10 ml使酸度基本控制在20%左右。由于酸度过大对仪器的断流系统有腐蚀作用,实验选择载流为5%盐酸。 图2　盐酸对荧光强度的影响 2.6　干扰实验 消解液中K、Na、Ca、Mg等离子含量较高,但不干扰测定;一些能形成氢化物的元素如Hg、Bi、Sb、As的干扰实验表明,在测定条件下, 500μg/L的Bi、Hg、Sb、As不干扰测定结果,Cu2+、Bi3+、Ni2+等的存在对Se的荧光信号有干扰,加入一定量的铁氰化钾作掩蔽剂可以消除许多过渡金属元素的干扰,并使硒化氢较好的发生。实验结果表明,当加入0.3 mol/L铁氰化钾溶液1 ml时, 500倍的Cu2+、Bi3+、Ni2+对Se的测定没有干扰。 2.7　标准曲线、检出限及精密度 在相同试验条件下,对Se(0~200μg/L)标准溶液进行测定,得到良好的Se标准曲线线性, Se的线性方程为Y=45.44X+5.05,相关系数r=0.9999。连续对空白标准管进行11次测定,用3倍的空白标准管标准差除以标准曲线的斜率,得到检出限0.088μg/L。分别对Se 40.0, 120.0, 200.0μg/L的标准系列连续测定11次,测定结果见表2。 表2　方法的精密度 2.8　样品测定结果 对市场上销售的4种保健品中的有机硒和总硒含量进行采样分析,结果见表3。 表3　样品中总硒、有机硒的测定含量 2.9　标准加入回收试验 因有机硒标准品不易获得,对有机硒的加标回收不好直接测定,实验通过对4种样品总硒加标回收试验和利用萃取后的水层中无机硒进行加标回收试验,测定结果见表4和表5。从测定结果来看,有机硒的测定具有很高的准确度。 表4　总硒的加标回收试验 表5　无机硒的加标回收试验 参考文献 [1]苗键,高崎,许思来.微量元素与相关疾病[M].郑州:河南医科大学出版社, 1998.8. 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