聚山梨酯80中挥发性杂质检测方案(毛细管柱)

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西北药学杂志 2015年7月 第30卷 第4期364 ·药物分析· GC法同时测定聚山梨酯80中5种挥发性杂质 李 莉，王佳宇，高山山，侯文珍，马长华*(北京中医药大学中药学院，北京 100102) 摘要：目的 建立气相色谱法对聚山梨酯80中的环氧乙烷、二氧六环、氯乙醇、乙二醇和二甘醇5种挥发性杂质进行同时检测。方法 采用气相色谱法，色谱柱固定相为 PEG20000 (GsBP-INOWAX，30 m×0.53 mm×1.0 um弹性石英毛细管柱)。采用程序升温，初温50℃，以5℃·min升温至200℃，保持10 min，再以50℃·min升温至230℃，保持20 min。进样口温度为200℃，检测器温度为250℃。结果 同时测定了聚山梨酯80中环氧乙烷、二氧六环、氯乙醇、乙二醇和二甘醇5种挥发性杂质，线性范围分别为2.7~176.8 ugmL-(r=0.999 8)，2.8~140.7 ug·mL-(r=0.999 8)，3.4~167.5 ug·mL-(r=0.999 9)，4.7~2345 ug·mL-(r=0.999 8)和3.2~160.8 ugmL-(r=0.999 9)；平均加样回收率分别为 104.3%，91.3%，105.2%，94.1%和105.7%，RSD分别为2.5%，2.8%，1.4%，3.0%和3.7%。结论 i该方法灵敏、准确，可用于聚山梨酯80中挥发性杂质的检测。 关键词：聚山梨酯80；挥发性杂质；气相色谱法 doi：10.3969/j. issn.1004-2407.2015.04.011 中图分类号：R927.2 文献标志码：A 文章编号：1004-2407(2015)04-0364-04 Determination of five volatile impurities in polysorbate 80 by GC LI Li， WANG Jiayu， GAO Shanshan， HOU Wenzhen， MA Changhua* (School of Medicine，Beijing University of Chinese Medi-cine， Beijing 100102，China) Abstract：Objective To establish a method for the determination of five volatile impurities in polysorbate 80. Method The determination was performed on a GsBP-INOWAX column with PEG20000(30m×0.53 mm×1.0um) as solid phase. The column temperatures was 50 ℃ at beginning， and programmed to 200 ℃ at a rate of 5℃·min， maintained for 10 min； then programmedto 230 ℃ at a rate of 50℃· minand held for 20 min. The temperatures of the injector and detector were set at 200 and 250℃，respectively. Result Five volatile impurities in polysorbate 80 were determined simultaneously by gas chromatography. The calibrationcurves were linear in the ranges of 2. 7-176.8 ug· mL-(r=0.999 8)，2.8-140.7 ug·mL-(r=0.999 8)，3.4-167.5 ugmL(r=0.999 9)，4.7-2 345 ug·mL-(r=0.999 8)，and 3.2-160.8 ug·mL-(r=0. 999 9) for ethylene oxide，dioxane， ethylenechlorohydrin，ethylene glycol and diethylene glycol， respectively. The average recoveries were 104.3%，91.3%，105.2%，94.1%and 105.7%，RSD were 2.5%，2.8%，1.4%，3.0% and 3.7%，respectively. ConclusionThe method were proved to be accurateand sensitive， and can be used for the detection of the volatile impurities in polysorbate 80. Key words： polysorbate 80； volatile impurities； gas chromatography 聚山梨酯80(Tween-80， polysorbate 80)是一种非离子型表面活性剂，由于其结构中具有较长的碳链结构，对亲脂性药物有较好的助溶作用，因此该产品常被用作注射液及口服液的增溶剂或乳化剂[1-2]。但近年来临床上含聚山梨酯80的注射剂多有不良反应发生，如：因严重不良反应被国家食品药品监督管理局暂停使用的鱼腥草注射液，其中所含辅料聚山梨酯80就是引起不良反应的重要原因之一[3]。据豚鼠、Beagle 犬、食蟹猴、体外RBL-2H3细胞、人血清补体等大量实验研究证实，聚山梨酯80与动物不良反应的出现存在明显关系；聚山梨酯80是一种聚合物，稳定性不佳，其含有的杂质或降解产物可能是致敏的主要原因41，如环氧乙烷、二氧六环、氯乙醇、乙二醇、二甘醇等51，而该类物质在相关药理学研究中已被证 ( 基金项目：国家自然科学基金项目(编号：81274070) ) ( 作者简介：李莉，女，在读硕士研究生 ) ( *通信作者：马长华，男，教授，硕士生导师 ) 明，对机体神经、细胞等存在不良反应L6-9。因此，对聚山梨酯80中可能含有的该类潜在不良反应因素的监控，对于保证临床用药安全具有重要的意义。由实验结果可知，建立测定5种杂质的气相色谱方法简便灵敏，结果准确，重复性好。 1仪器与试药 仪器 安捷伦气相色谱仪，型号7890A(FID 检测器，安捷伦自动进样器型号7683B)；电子天平(上海越平科学仪器有限公司，型号JA2003)。 1.2 试药 对照品：氯乙醇(Sigma 公司进口分装，规格1mL)；乙二醇(上海源叶生物科技有限公司，规格5mL)；二氧六环(中国食品药品检定研究院，规格 200 mg)；二甘醇(中国食品药品检定研究院，规格100 mg)；环氧乙烷(中国食品药品检定研究院，规格5 mL)。聚山梨酯80(批号205359C，日本 NOF公司；批号20130701，南京国内某公司注射级别；批号ZY130911，上海国内某公司药用级别；批号 20130101，20130401，20101201，国内某公司)。无水乙醇(色谱级别，Fisher公司)。 2 方法与结果 2.1 对照品溶液的制备 精密吸取环氧乙烷、氯乙醇、乙二醇、二氧六环、二甘醇对照品，分别加无水乙醇配制成每1mL含氯乙醇50 pg二醇800 pg、二氧六环50 pg、二甘醇50 pg和环氧乙烷 44.2 pg的对照品溶容。 2.2 供试品溶液的制备 精密称取聚山山酯80 4g置于10 mL量瓶中，加无水乙醇定容，摇匀，配制成每1mL 含 400 mg聚山梨酯80的供试溶液。 2.3 色谱条件 色谱柱固定相为 PEG20000 (GsBPINOWAX，30 m×0.53 mm×1.0 um弹性石英毛细管柱)。采用程序升温，初温50℃，以5℃·min升温至200℃，保持10 min，再以50℃·min升温至240℃，保持20 min。进样口温度为200℃，检测器温度为250℃，分流比为10：1，进样量1pL，柱压力恒定方式，载气为氮气(99.999%)，柱流速3mL·min-1.色谱图见图1。 0 5 10 15 20 25 30 35 4C t/min C 图1 气相色谱图 A. 空白溶液；B.样品；C.对照品；1.环氧乙烷；2.二氧六环；3.氯乙醇；4.乙二醇；5.二甘醇 Fig.1 GC chromatograms A. blank ；B. sample； C. reference； 1. ethylene oxide； 2. di-oxane；3. ethylene chlorohydrin； 4. ethylene glycol； 5. dieth-ylene glycol 2.4 线性范围 分别取环氧乙烷、氯乙醇、乙二醇、二甘醇、二氧六环对照品适量，加无水乙醇依次稀释成下列标准溶液：环氧乙烷2.7，5.7，11.1，23.0，44.2，88.4和176.8ug·mL；氯乙醇3.4，6.7，14.1，30.2，55.3和167.5 ug·mL；乙二醇4.7，46.9，93.8，197，422，774和2345 ug·mL-；二甘醇3.2，6.4，13.5，28.9，53.1和160.8 ug·mL；二氧六环2.8，5.6，11.8，25.3，46.4和140.7 pg·mL-。取 1 pL进样分析，以各对照品峰面积积分值Y对进样质量浓度X进行线性回归，计算，结果见表1。结果表明，环氧乙烷质量浓度在2.7~176.8ug mL-范围内，氯乙醇质量浓度在3.4~167.5pg·mL-范围内，乙二醇质量浓度在4.7~2345ug·mL-范围内，二甘醇质量浓度在3.2~160.8 ug·mL-的范围内，二氧六环质量浓度在2.8~140.7 ug·mL范围内线性关系良好. 表1 回归方程与线性范围 Tab. 1 Linear range and regression equations of calibrationcurves 对照品 回归方程 线性范围 /pg·mL-1 环氧乙烷 Y=2.012 8X+1.064 0.9998 2.7~176.8 二氧六环 Y=0.5477X-0.0273 0.999 8 2.8~140.7 氯乙醇 Y=0.302X-0.0443 0.9999 3.4~167.5 乙二醇 Y=390.22X-2.0413 0.9998 4.7~2345 二甘醇 Y=0.4026X 《十 1.6684 0.999 9 3.2~160.8 2.5 定量限和检测限 取对照品储备液，精密量取不同体积并逐步稀释，按上述方法进样并测定，当所测残留溶剂的信噪比达到要求时，环氧乙烷、二氧六环、氯乙醇、乙二醇、二甘醇检测限(S/N=3)分别为0.9×10-4，1.1×10-4，1.2×10-4，0.9×10-4和1.1×10-4ug；定量限(S/N=10)分别为2.7×10-4，2.8×10-4，3.4×10-4，2.5×10-4和2.8×10-4ug， 2.6 精密度 取同一对照品溶液，于同1d内按色谱条件连续进样6次，计算峰面积，考察精密度，环氧乙烷、二氧六环、氯乙醇、乙二醇和二甘醇的 RSD 分别为1.1%，1.7%，1.9%，1.0%和为0.7%，方法精密度良好。 2.7 加样回收率 精密称取环氧乙烷、二氧六环、氯乙醇、乙二醇、二甘醇适量，分别加无水乙醇依次稀释成下列溶液：环氧乙烷 0.10，0.17 和0.23 mg·mL；氯乙醇0.61，0.76和0.92 mg·mL；乙二醇2.91，4.84和6.78mg·mL；二甘醇0.23，0.38和0.53 mg·mL；二氧六环0.61，0.76和0.92 mg·mL。共制3份。称取聚山梨酯80样品2g，共9份，分3组，分别置于10 mL量瓶中，每组分别精密加入上述氯乙醇、乙二醇、二甘醇混合溶液，无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1pL进样分析，计算回收率。环氧乙烷、二氧六环、氯乙醇、乙二醇、二甘醇的平均回收率分别为105.7%，104.3%，91.3%，105.2%和94.1%；RSD 分别为3.7%，2.5%，2.8%，1.4%和3.0%。详见表2。 表2 加样回收率实验结果Tab.2 Results of addition recoveries test 2.8 重复性 分别称取6份聚山梨酯80样品，置于10 mL量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀。精密 量取1pL进样分析，环氧乙烷、乙二醇、二甘醇的RSD分别为1.1%，1.4%和1.4%，重复性良好；二氧六环和氯乙醇在样品中未检测到。 2.9 稳定性 称取4g聚山山梨80样品，置于10mL量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀。分别在0，2，4，6，8，12和24h精密取1pL，进样分析。环氧乙烷、乙二醇和二甘醇的 RSD 分别为2.8%，3.5%和3.9%；二氧六环和氯乙醇在样品中未检测到。 2.10 样品测定 按照2.2项下配制样品供试液，每个样品3份分别测定，最终含量取平均值。结果见表3。 表3 聚山梨酯80样品中5种挥发性杂质含量测定结果 Tab. 3 Results of determination of five volatile impurities inpolysorbate 80 批号 含量/% 环氧乙烷 二氧六环 氯乙醇 乙二醇 二甘醇 1 / 0.0160 0.0094 2 0.0057 0.0042 3 / / 0.0058 0.0040 4 / / 0.0069 0.0053 5 / / 0.0083 0.0056 6 0.0071 / 0.2000 0.0140 3 讨论 《中国药典》(2010年版)中规定，聚山梨酯80中环氧乙烷和二氧六环的限量应分别为小于1 ppm 和10 ppm10。根据样品的测定数据，表明样品中均未检测到二氧六环和氯乙醇；仅有1批样品测出含有环氧乙烷，但含量远远超出药典规定的70倍。另外，所有样品中均检测到乙二醇和二甘醇。 从实验结果分析，市场上不同厂家生产的药用级聚山梨酯80的质量差异较大，并有待提高和改善。《中国药典》(2010年版)虽然对聚山梨酯80的相关规定进行了完善，但尚未提出相关条例对乙二醇和二甘醇这2种可能引发不良反应的副产物进行控制，建议增添相应标准对乙二醇和二甘醇的限量进行控制。本研究所建立的方法检测限低，精密度及重复性好，能有效地同时对样品中5种挥发性杂质的残留量进行检测。 ( 参考文献： ) ( [1] 董媛，张张华，刘莹莹，等. ·中药注射剂中添加聚山梨酯80的快速检测[J].西北药学杂志，2010，25(4)：248- 2 4 9 . ) ( [2] 孙会敏，杨锐，栾琳，等.聚山梨酯80质量分析与致敏原探究[J].药物分析杂志，2011，31(10)：1850-1855. ) ( [3] 曾聪彦，梅全喜.论影响中药注射剂安全性问题的因素[J].中华中医药学刊，2010，28(3)：614-617. ) ( [4] 孙伟伟，李贻奎，张金艳，等.吐温80及其配制的鱼腥草注射液致豚鼠变态反应的实验研究[J].中药新药与临床药理，2011，22(1)：47-51. ) ( [5 ] ] 栾琳，杨锐，汤龙，等.毛细管气相色谱法测定吐温80 ) ( 中氯乙醇、乙二醇、二甘醇的含量[J].药物分析杂志， 2010，30(10)：1869-1872. ) ( 6 Buyer E W， M a jia M ， Woolf A，et al . S ev ere ethylene glycol injestion treate d without hemodialysis[J]. Pedi-atrics ， 2001， 107(1) ： 172-173 ) ( 张霞，周雯，王有森.环氧乙烷在灭菌物品中残留量测定及毒性研究进展[J].中国消毒学杂志，2005，22(2)： 217-218. ) ( [8] 程能林.溶剂手册[M] . 4版.北京：化学工业出版社， 2007： 5 51. ) ( [9 张锦周，庄志雄.氯乙醇急性染毒对大鼠肝抗氧化酶与脂质过氧化物影响的研究[J].中国实验动物学杂志， 1998，8(3)：135- 1 37. ) ( [10 ] 国家药典委员会.中国药典2010年版[S].二部.北京：中国医药科技出版社，2010：1246-1257. ) ( (收稿日期：2015-03-09) ) 顶空气相色谱法测定药酒中的甲醇量 王 芍，牛宇东*，魏 萍(西安市食品药品检验所，西安 710054) 摘要：目的 建立药酒中甲醇量的测定方法。方法 采用顶空-气相色谱法，色谱柱为 Agilent Technologies DB-WAX (30m×0.32 mm×0.25 pm)，FID检测器；进样口温度：140℃；检测度温度220℃；载气流速：0.3mL·min；梯度升温：29℃保持1 min，以0.5℃·min速率升至31℃，保持10 min，以5℃·min率率升至65℃，保持1 min，以50℃·min速率升至200℃，保持2 min；时间周期：38 min。结果 甲醇在0.0001~0.005mL·mL-范围内线性关系良好，r=0.999 4，平均回收率为99.6%，RSD 2.5%(n=6)。结论 该方法检测结果准确、专属性强、灵敏度高、重复性好，可用于药酒中甲醇量的控制。 关键词：甲醇；药酒；顶空气相色谱法 doi：10.3969/j.issn.1004-2407.2015.04.012 中图分类号：R927.2 文献标志码：A 文章编号：1004-2407(2015)04-0367-03 Determination of methanol in herb wine by headspace GC with capillary column WANG Shao，NIU Yudong*，WEI Ping(Xi an Institute for Food and Drug Control， Xi an 710054， China) Abstract：Objective To establish a method for determination of methanol in the herb wine. Methods Head space GC with capillarycolumn Agilent Technologies DB-WAX(30 m×0.32 mm×0.25 um) was used，and the detector was FID. The injector temperaturewas 140℃，the detector temperature was 220℃， and the velocity of carrier gas was 0.3 mL·min. The column temperaturewas changed according to the following program：initial temperature was kept at 29C for 1 min，then raised to 31 ℃ at the rate of0.5℃·min1， maintained for 10 min， then raised to 65℃ at the rate of 5℃·min-1， maintained for 1 min， then raised to 200℃ at the rate of 50℃·min， maintained for 2 min. The cycle time was 38 min. Results Methanol showed a good linear relationship in the range of 0. 000 1-0.005 mL·mL-(r=0.999 4)，and the average recovery was 99.6% with RSD 2.5%(n=6).Conclusion This method is simple and accurate， has a strong specificity， high sensitivity and fine reproducibility. It could be usedto determine methanol in herb wine. 药酒是常用的中药制剂，具有舒经活血、温通发散、引药归经等独特的功效，在临床上被广泛应用。但其生产过程中会产生微量的甲醇，也有不法分子采用工业乙醇勾兑药酒，其甲醇含量较高，会引起头痛、恶心、失明甚至死亡，严重危害人民群众的身体健康。因此在《中国药典》2010年版一部中严格规定了甲醇量的限度，不得超过万分之五2。 目前检测药酒中甲醇量的方法主要有光度法[31.气相色谱法41、极谱法5，其中应用最多的是气相色谱法。而顶空气相色谱法6可以免除冗长繁琐的样品前处理过程，避免有机溶剂带入的杂质对分析造成干扰，减少对色谱柱及进样口的污染，有利于对小分子发性有机成分进行准确测定。本文采用顶空气 ( 作者简介：王芍，女，中药师 ) 相色谱法对虫草双参酒中的甲醇进行测定，结果表明该方法简单，专属性强、灵敏度高、重复性好，可用于药酒中甲醇量的质量控制。 仪器与试药 1.1 仪器 Agilent Technologies 7890A 气相色谱仪(包括 Agilent Technologies G1888 顶空进样仪；FID检测器)；Agilent Chemstation色谱工作站；2CmL顶空进样瓶，聚四氟乙烯薄膜包裹的硅橡胶塞，铝封套。 1.2 试药 虫草双参酒(批号20120319，20120320，20120401，西安阿房药制药有限公司)。实验用水为超纯水(Millipore 公公)；甲醇(Fisher Scientific 色谱纯)；高纯氮气；高纯氢气；干燥空气。 2方法与结果 2.1 色谱条件 毛细管柱： Agilent Technologies DB- ?China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net