水产品中土霉素检测方案(固相萃取仪)

智能文字提取功能测试中

全自动固相萃取(EXTRA) 结合 HPLC 测定水产品中 PreeKem 屹尧科技 四环素、金霉素、土霉素的残留量 编号：ANI1404 摘要： 本方法参考《SC/T3015-2002水产品中土霉素、四环素、金霉素残留量的测定》标准，建立了利用全自动固相萃取仪(EXTRA)结合高效液相色色(HPLC)检测水产品中土霉素、四环素、金霉素残留量的方法。样品绞碎后，经高氯酸提取，用C18柱净化，浓缩，微孔滤膜过滤后，直接进样，用反相色谱分离，紫外检测器检测。目标化合物的回收率和RSD 均较好。本方法简便、灵敏、重现性好、干扰少、特异性好、能满足食品安全法规的需要。 关键词：金霉素，土霉素，四环素，水产品， EXTRA， HPLC 01 四环素类抗生素包括土霉素、四环素和金霉素等，属广普类抗生素药物，由于其具有良好的杀菌或抑菌作用而广泛用了防治动物和水产品的疾病感染。我国水产品养殖濫用抗生素现状令人忧心。据媒体报道，中国每年生产抗生素原料大约21万吨， 其中有9.7万吨抗生素用于畜牧水产养殖业，占年总产量的46.1%。人长期摄入含抗生素残留的水产 品后，药物不断在体内蓄积，当浓度达到一定量后，就会对人体产生毒性作用，四环素类药物的毒性反应主要表现为对胃、肠、肝脏的损害及牙齿的染色等。还会造成过敏反应，二重感染，致畸胎作用。因此，准确、快速、有效的检测水产品中四环索类药物的残留量是十分必要的。 本文参考《SC/T3015-2002水产品中土霉素、四环素、金霉素残留量的测定》标准，建立了利用全自动固相萃取仪(EXTRA)结合高效液相色谱 HPLC 检测四环素、金霉素、土霉素在水产品中的残留量的方法。在提取完成后，选用EXTRA全自动固相萃取仪，免人工干预，自动完成 SPE 柱活化、样品上样、目标物洗脱和收集等步骤，释放了大量实验室劳力。收集液再经氮吹浓缩、溶剂转换定容后，以高效液相色谱完成了水产品中四环素、金霉素、土霉素残留量的测定。本方法具有精确可靠、灵敏度高、重复性好以及节省分析时间和流动相的消耗量等优点，可以满足准确、快速的检测需要，运用到实际样品的检测中结果令人满意。 1.1 试剂 除另外有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水为一级水。 乙腈：HPLC级。 甲醇：分析纯。 正己烷：分析纯。 水：实验室用水。 0.01mo/L磷酸二氢钠溶液：称取1.56g(尔准至0.01g)分析纯磷酸二氯钠( NaH2PQ4.2H2O)溶于蒸馏水中，定容至1000mL， 以磷酸调 pH至2.5，经微孔滤膜(0.45um)过滤后备用。 0.5%高氯酸溶液。 5%乙二胺四乙酸二钠溶液：取5g分析纯乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)溶解定容至100mL 土霉素、四环素、金霉素混合标准溶液：溶剂 为 0.01mol/L的磷酸二氢钠溶液，土霉索、四环素浓度为10p g/ml， 金霉素浓度为20pg/ml. 氮气：纯度大于99%。 1.2仪器及器材 高效液相色谱仪：紫外检测器；分析天平；旋涡混合仪；超声仪：离心机：4000r/min；固相萃取柱： CNW-C18； 全自动固相萃取仪(上海屹尧EXTRA)。 2.1提取 称取5.000g±0.001g样品， 置于50ml离心管中，加入300pl土霉素四环素金霉素混标，加入0.5%高氨酸溶液 10ml，于旋涡混合仪上漩定涡混合30s， 于超声仪中超声超取 15min，以4000r/min 离心 10min， 取上清液。向离心管中的残渣再加入0.5%高氯酸溶液5ml， 重复提取一次，合并上清液。加入 1ml 正己烷，混合 1min 后，离心，除去正己烷相，再加入1ml正己烷，混合1min 后，离心，除去正己烷相。水相取5ml放置于屹尧自动 SPE 装置的上样架上，待上样。 2.2净化 C18固相萃取柱依次用5mL甲醇、5mL水活化，取备用液过柱，用5mL水淋洗，抽干，用5mL甲醇洗脱，收集洗脱液。 2.3分析 收集的洗脱液在40℃水浴中氮气吹干，以甲醇定容至1.0ml， 以0.45pm滤膜过滤，滤液待进样。土霉素四环素金霉素混标稀释10倍，待进样。土霉素、四环素浓度为 1 pg/ml，金霉素浓度为2ug/ml。 2.4仪器条件 2.4.2色谱条件 2.4.1 EXTRA净化程序 色谱柱： CNW-C18。 EXTRA 净化程序如表1所示(见下表1)： 检测器：紫外检测器，检测波长为355nm。 灵敏度： 0.002AUFS。 柱温：37℃。 表1 EXTRA 净化程序 流速： 1.0ml/min。 进样量：30pl. 流动相：乙腈和0.01mol/L磷酸二氢钠溶液的体积比为 26：74。色谱分析：分别吸取30pl稀释后的标准混合溶液和净化后的样品溶液注入色谱仪中，以保留时间定性，以样品溶液峰面积和标准溶液峰面积比较定量。 动作 位置 溶剂 体积 抽溶剂速度 打溶剂速度 mL1 ImLAin 清洗 外针 水 6 120 120 甲醇 5 20 2 活化 5%乙乙陵二纺溶液2 20 2 水 5 20 2 空气 1 60 60 上样 样品溶液 5.1 20 1.5 空气 0.5 20 1.5 清洗 外针 水 6 120 120 淋洗 水 10 20 2 空气 8 60 洗脱 甲醇 20 1 空气 6 60 60 通过高效液相色谱分离，利用紫外检测器检测，在2.4.2色谱条件下，标准溶液、加标样品的色谱图如下所示： 由图中可以看出，各目标化合物的色谱保留时间重现性良好，样品经净化后，色谱分离行为良好。 图1湿标色滑图 图2加标样品色图 表2土霉素回收率： 3.2加标回收率及精密度在5.000g±0.001g空白样品中添加300uL标准混合溶液，平行十份，进行加标回收实验。加标回收率、相对标准偏差如右表2、表3所示： 表2回收率： No. min mAU*min 1 STD1PPM 3.801 02451 0.2510 2 STD1PPM 3.806 02471 3 |STD1PPM 3.751 0.2609 回收率 4 S1 3.805 |02297 92% 5 S2 3.800 02529 101% 6 S3 3.801 02390 95% 7 S4 3.786 02428 97% 8 S5 3.793 02329 93% 9 H1 3.795 02277 91% 10 H2 3.795 02514 100% 11 H3 3.786 0.2432 97% 12 H4 3.780 02416 96% 13 H5 3.783 |0.2202 88% 表2金霉素回收率： No. min mAUmin 1 STD1PPM 8.071 02060 0.2026 2 STD1PPM 8.081 02038 3 STD1PPM 7.858 0.1980 回收率 4 S1 8.045 0.1840 91% 5 S2 |8.031 02042 101% 6 S3 8.023 0.1892 93% 7 S4 8.015 0.1960 97% 8 S5 |8.003 0.1887 92% 9 H1 8.005 0.1775 88% 10 H2 8.010 0.1932 95% 11 H3 8.000 0.1739 86% 12 H4 7.993 0.1909 94% 13 H5 7.990 0.1710 84% 表3平均回收率及相对标准偏差： 化合物 平均回收率n=10 RSD 土霉素 95.0% 4.06% 四环素 93.5% 4.03% |金霉素 92.1% 5.13% 3.3样品检测结果 按照本文所述方法对实际样品进行分析，从上面3.1色谱图中可以看出，样品中的土霉素、四环素、金霉索能够很好地被分离，基本无干扰峰，且分析时间较短， 只需10min 即可完成一次分析。说明本方法用到实际样品检测中可以得到较好的分离分析结果。 本方法适用于大批量样品的同时检测，样品量大，所以本实验采用了EXTRA全自动固相萃取仪进行净化处理，免人工干预，自动完成 SPE 柱活化、样品上样、目标物洗脱和收集等步骤。全自动固相萃取仪采用正 压技术控制液体流速，保证液体传送的准确性和重现性，从而避免了重复的人工操作及人为误差，并且能够确保良好的重现性和精确性，便于方法的实验室间转移，也便于建立行业乃至国家的实验室标准。 4结论 本方法采用高氯酸对样品中土霉素。四环素、金霉索进行提取，全自动固相萃取进行样品净化，有效地去除了样品中的干扰成分，然后利用高效液相色谱仪.紫外检测器进行检测、检测结果表明，该方法抗干扰性强，具有较高的灵敏度，回收率符合要求，精密度 RSD 值也都较小，运用到实际样品的检测中结果令人满意。因此本方法可以满足准确、快速的检测需要，能够适应大规模样品的快速分析。 ( 参 考 文 献 ) ( [ 1I《 S C / T 3 015-200 2 水 产 品中 土霉素 、 四环素、 金霉素残留量的 测 定 》 ) EXTRA 全自动固相萃取仪