检测样品 茶叶
检测项目 多菌灵
参考标准 GB/T 23205 茶叶中448种农药及相关化学品残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
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食品安全-农药残留分析应用 应用文集 Chen-Hao Zhai 安捷伦科技(中国)有限公司 中国上海英伦路412号, 邮编200131 本应用报告介绍了使用快速、简便、经济、高效、耐用和安全 (QuEChERS)的 EN样品制备方法来萃取和净化绿茶中具有代表性的12种农药。最初的 EN 法包括在缓冲液/乙乙系统中进行的预萃取,加入盐分后的萃取/分配步骤,以及使用分散固相萃取(分散SPE)的样品净化步骤。采用液相色谱-电喷雾电离串联质谱法(LC-ESI-MS/MS)在正离子多反应监测(MRM)模式下测定绿茶提取物中存在的目标农药。并针对所有目标分析物的回收率和重现性进行了方法验证。本应用绿茶中农药的定量限(LOQ)为5ng/g,远低于规定的最大残留限量(MRLs)。回收率实验的加标浓度为10、50和250 ng/g。平均回收率大都在87%~108%范围内(平均值为93.5%), RSD 低于10%(平均值为5.2%)。 引领分分科技尽在北京谱朋-企业QQ:40061 65163 前言 EN QuEChERS方法已被广泛应用于食品中农药的分析,尤其是在欧洲[1-2]。该方法先用乙腈萃取样品,然后用无水硫酸镁(MgSO)、 NaCl和缓冲柠檬酸盐将样品中的水分盐析出来,形成液液分配。净化过程采用分散固相萃取(分散SPE) 以及N-丙基-乙二胺 (PSA) 羊去样品基质中的有机酸,并用无水MgSO除去萃取物中残留的水分。根据不同的食品基质,可能还会使用不同的净化成分,如使用石墨化碳黑 (GCB)以除去色素和甾醇,或者添加C18以除去脂类和蜡。 由于绿茶含有大量的叶绿素,因而属于高色素样品。因此,本应用选择适用于高色素产品的 EN 分散 SPE 试剂盒。该类试剂盒包含25mg PSA 和150mgMgSO, 适用样品体积为1mL。每毫升乙腈萃取液还应添加 7.5 mg GCB。 GCB 可吸附平面结构分子,如色素和甾醇,因此它有助于净化高色素基质样品,如绿茶。净化 效率取决于 GCB 的用量。 GCB用量越大,可吸附的平面结构分子越多,从而能得到更纯净的样品基质。相对于 AOAC 法中使用相对较多的 GCB (每毫升乙腈萃取液添加50 mgGCB), EN法中使用的 GCB要低得多(处理“含色素”的样品时,每毫升乙腈萃取液添加 2.5 mg GCB; 处理“高色素”样品时,每毫升乙腈萃取液添加7.5mg GCB)。平面结构农药的萃取率会受到 GCB加入量的影响。AOAC 法可得到更为纯净的样品基质,但易造成平面结构农药的大量损失。与此相反, EN 法几乎不会引起平面结构农药的损失,但得到的样品基质会更为复杂。 本研究采用12种农药评估 Agilent Bond Elut EN 缓冲萃取试剂盒(部件号5982-5650)和用于高色素水果蔬菜的 Bond Elut QuECh-ERS EN 分散 SPE试剂盒(部件号5982-5356)的性能。并对该方法的回收率和重现性进行了验证。表1为绿茶中这些农药的化学结构和相关限量信息。 表1. 农药的化学及限量信息[3-5] MRLs 名称 分类 Log P pKa 结构 (ng/g)* 乙酰甲胺磷 有机磷酸酯 -0.89 8.35 O II 20 HS 胺甲萘 氨基甲酸酯 2.36 10.4 NH 50 0 O 多菌灵 苯并咪唑 1.48 4.2 100 -NH ^N -OCH3 嘧菌环胺 苯氨基嘧啶 4 4.44 N N 500 (接下页) 5990-6400CHCN 引领分分科技尽在北京谱朋-企业QQ:40061 65163 食品安全-农药残留分析应用 MRLs 名称 分类 Log P pKa 结构 (ng/g)* 抑霉唑 咪唑 3.82 6.53 CI /=CH 20 CI- -N N 吡虫啉 新烟碱 0.57 NA N CI N -NO, 1000 NH 戊菌唑 三唑 3.72 1.51 CI、 CI 50 N N 残杀威 氨基甲酸酯 0.14 NA 2000 O、 吡蚜酮 吡啶 -0.19 4.06 600 N、 .NH ^N 0 N 涕必灵 苯并咪唑 2.39 4.73 50 12.00 S N N- 灭线磷 有机磷酸酯 2.99 NA H3CC、 5 O S .CH, H3C N 实验部分试剂和化学品 所有试剂和溶剂均为 HPLC 级或分析级。甲醇 (MeOH) 和乙腈 (ACN)均购自 Honeywell 公司(Muskegon, MI, USA)产品;甲酸 (FA)购自 Fluka公司(Sleinheim,Germany);农药标准品购自 Sigma- Aldrich 公司(StLouis,MO, USA);内标物(磷酸三苯酯, TPP) 由 安捷伦科技有限公司(Wilmington, DE,USA)提供。 标准溶液 标准品和内标物 (IS)储备液(除多菌灵为 0.5 mg/mL外,其余均为2.0mg/mL) 另别用 MeOH、0.1%甲酸的乙腈溶液和 DMSO配制, 于-20℃储存。以0.1%甲酸的乙腈/水(1:1) 溶液每天新鲜配制三种QC加标溶液,浓度分别为0.2、1和10pg/mL, 并采用同样的溶剂制备2 pg/mL 的 TPP溶液作为 IS 加标溶液。 仪器和材料 ( Agilent 1200 系列 HPLC (Agilent Technologies Inc., CA, U S A) 配备电喷雾离子源的 Agilent 6410三重四重杆MS 系统 (Agilent T echnologies Inc., CA, USA) ) Agilent Bond Elut QuEChERS EN Buffered Extraction缓冲萃取试剂盒,部件号5982-5650;用于高色素水果蔬菜的Bond ElutQuEChERS EN 分散 SPE试剂盒,部件号5982-5356 (AgilentTechnologies Inc., DE, USA) 安捷伦陶瓷匀质子, 50 mL离心管,部件号 5982-9313 (AgilentTechnologies Inc., DE, USA) Eppendorf 微型离心机 (Brinkmann Instruments, Westbury, NY,USA) 飞鸽离心机(上海安亭科学仪器厂) 样品制备 样品粉碎 无农药的有机绿茶录自 Teavana 公司。将绿茶装在干净塑料袋, 于-20℃冷冻过夜。时常揉捏袋子以确保茶叶分散。次日,取出所需 与分析物相关的其它条件列于表 2。 量的冰冻茶叶彻底粉碎。可能的话,粉碎时加入干冰。将样品彻底粉碎以得到均质样品。检查最终样品,应无可见的明显茶叶碎片。 提取/分散 称取均质样品2g(±0.1g), 置于50 mL离心管中。加入100pL适当的 QC标液制成 QC 样品。除空白对照外,所有样品均加入100pL IS 溶液 (10 pg/mL TPP溶液),使样品溶液中内标物浓度为50 ng/g。离心管加盖,涡旋1 min。后往各离心管中加入8 mL水,加盖,涡旋1 min。然后将 50 mL 离心管的两个陶瓷均质子(部件号5982-9313)加至各离心中中。然后往各离心管中加入10mL乙腈,加盖,振摇1 min。再往各离心管中直接加入 AgilentBond Elut QuEChERS EN 萃取盐包,含4g无水MgS0、1gNaCl、 1g柠檬酸三钠和0.5g柠檬酸二钠盐1.5水合物。盖紧离心管,剧烈振摇20s以确保溶剂与样品充分接触,并使晶体块完全分散。样品管以4000 rpm 的转速离心5 min。 表2. 用于分析12种农药的 LC/MS/MS仪器采集数据 MRM 通道(m/z) CE (V) RT (min) 乙酰甲胺磷 1)184.0>143.0 60 3 1.66 2)184.0>95.1 吡蚜酮 1) 218.1>105.1 125 1.95 2)218.1>78.1 多菌灵 1)192.1>160.1 110 3.25 2) 192.1>132.1 涕必灵 1)202.0>175.1 145 3.37 2)202.0>131.1 吡虫啉 1) 256.1>209.1 125 4.02 256.1>175.1 抑霉唑 2)2 1)297.1>159.0 110 4.40 2)297.1>69.1 残杀威 1)210.2>111.1 70 4.81 2)2210.2>93.1 胺甲萘 1)202.0>145.0 50 4.98 2)2202.0>127.1 1)226.1>93.1 嘧菌环胺 125 5.84 2)226.1>108.1 灭线磷 1)243.1>130.9 125 5.98 2) 243.1>173.0 戊菌唑 1)284.0>70.1 120 6.20 2)284.0>159.0 醚菌酯 1) 314.1>222.1 90 6.62 2) 314.1>235.1 TPP (IS) 1)327.1>77.1 160 6.80 2)327.1>152.1 1) Quantifier transition 通道 2) Qualifier transition 通道 分散 SPE 净化 将6mL乙腈上清液转移至Agilent Bond Elut QuEChERS EN分散SPE 15 mL管(部件号5982-5356) 中, 每个15mL管内含 150 mgPSA、900 mg 无水 MgSO 和 45 mg GCB。 盖紧离心管,涡旋1 min, 再用标准离心机以 4000 rpm 的转速离心5 min。取1mL萃取液转移至10mL试管中, 在低于40℃温度下氮气吹干。残渣用1mL乙腈/水(1/9)复溶,再用 0.45 pm 的滤膜(部件号5190-5085)过滤后进行 LC/MS/MS分析。 结果与讨论 根据推荐,本研究中绿茶处理采用适用于高色素样品的EN分散SPE 试剂盒。采用 EN 法处理的最终样品仍呈现绿色,但是,LC/MS/MS选择性非常强大,空白基质的MRM谱图表明目标分析物无任何干扰峰。图1和图2分别为EN分散SPE 法处理的空白基质(添加 IS) 和加标 50 ng/g 绿茶提取物的 LC/MS/MS谱图。 引领分分科技尽在北京谱朋-企业QQ:40061 65163 应用文集 图1. 绿茶空白基质的 MRM 谱图。峰鉴别: IS: TPP 图2. EN 法处理的加标50 ng/g样品的MRM谱图。峰鉴别:1.乙酰甲胺磷,2.吡蚜酮,3.多菌灵,4.涕必灵,5.吡虫啉,6.抑霉唑,7.残杀威,8.胺甲萘,9.嘧菌环胺,10.灭线磷,11.戊菌唑,12.醚菌酯, IS: TPP 引领分分科技尽在北京谱朋-企业QQ:40061 65163 线性和定量限(LOQ) 所有检测农药的线性校准范围为5-500 ng/g。通过向空白基质加标制成浓度为5、10、50、250和500ng/g的一系列校准曲线溶液,用50 ng/g的 TPP溶液作为内标。通过分析物的相对响应值(分析物峰面积/内标物峰面积)与分析物的相对浓度(分析物浓度/内标物浓度)绘制标准曲线。所有农药的定量限 LOQ 为 5 ng/g, 均低 表3. 绿茶萃取物中农药的线性 名称 回归方程 R2 乙酰甲胺磷 Y=2.0260×+0.0347 0.9995 吡蚜酮 Y=2.3741×-0.0141 0.9999 多菌灵 Y=2.9630×+0.1685 0.9991 涕必灵 Y=1.5021×-0.0034 0.9998 吡虫啉 Y=0.0625×-0.0002 0.9998 抑霉唑 Y=0.9445×+0.0190 0.9997 残杀威 Y=1.8301× +0.0362 0.9998 胺甲萘 Y=0.3677×-0.0014 0.9999 嘧菌环胺 Y=3.0000×+0.0809 0.9991 灭线磷 Y=1.2764×+0.0425 0.9986 戊菌唑 Y=2.7559×+0.0259 0.9999 醚菌酯 Y=0.1976×+0.0119 0.9969 于水果蔬菜中这些农药规定的 MRLs。表3为相应的线性回归方程和相关系数(R2)。 回收率和重现性 通过在粉碎的样品中加入农药标准品对回收率和重现性进行评价,加标浓度分别为10、50和250ng/g。通过空白基质加标绘制的校准曲线进行这些QC样品的定量,每一浓度平行测定六次。回收率和重现性(以RSD 表示) 数据分别见表4和图3。结果显示,11种农药展现出极佳的回收率和精密度。吡蚜酮的回收率较低但精密度良好。这是由于吡蚜酮受 pH的影响较大, 在pH5-5.5范围内,易受提取过程中 pH的影响。多菌灵、涕必灵和嘧菌环胺与吡蚜酮一样都是平面结构的农药,在 d-SPE 阶段,由于使用了少量的GCB, 导致其回收率有所损失。 表4.采用QuEChERS 法测得加标绿茶的回收率和重现性 分析物 QC 加标浓度 10 ng/g QC 加标浓度 50 ng/g QC加标浓度250ng/g 回收率 RSD (n=6) 回收率 RSD (n=6) 回收率 RSD (n=6) 乙酰甲胺磷 80.5% 5.4% 91.7% 2.9% 88.9% 8.2% 吡蚜酮 43.1% 3.0% 42.2% 3.4% 43.4% 9.8% 多菌灵 114.6% 11.6% 97.6% 2.0% 105.0% 6.2% 涕必灵 98.1% 6.9% 90.4% 2.4% 81.7% 5.8% 吡虫啉 104.3% 11.7% 108.6% 2.5% 93.9% 7.9% 抑霉唑 97.5% 4.4% 87.8% 5.6% 92.4% 4.6% 残杀威 98.1% 2.4% 110.2% 1.7% 107.8% 3.9% 胺甲萘 89.7% 11.4% 104.9% 3.3% 108.1% 5.2% 嘧菌环胺 84.9% 2.1% 92.5% 3.7% 93.9% 5.5% 灭线磷 103.4% 3.1% 111.2% 3.2% 104.9% 5.7% 戊菌唑 108.7% 2.9% 94.3% 4.5% 89.8% 3.3% 醚菌酯 105.7% 12.4% 96.4% 2.5% 99.2% 5.5% 图3. 绿茶中12种农药的回收率和精密度结果 引领分分科技尽在北京谱朋-企业QQ:40061 65163 结论 Agilent Bond Elut QuEChERS EN缓冲液萃取试剂盒和用于高色素水果蔬菜的分散 SPE 试剂盒给我们提供了一种简便、快速和高效的用于绿茶中具有代表性农药的净化方法。分散 SPE中使用的少量GCB 基本不影响平面结构农药的萃取。基质加标测得的回收率和重现性表明,该方法可用于绿茶中多类型、多农药残留的测定。 ( 参考文献 ) ( 1. European Committee for r Standardization/Technical Committee C E N/TC 275 (20 0 7), Foo d s of plant origin:Determination of pesticide residues using GC-MS a n d/orLC-MS/MS following acetonitrile extraction/partitioningand cleanup b y dispersive SPE-QuEChERS m ethod. European Committee for Standardization, Brussels. ) 2. P. Paya,M. Anastassiades;"Analysis of Pesticide ResiduesUsing the Quick Easy Cheap Effective Rugged and Safe(QuEChERS) Pesticide Multiresidue Method in Combinationwith Gas and Liquid Chromatography and Tandem MassSpectrometric Detection", Anal Bioanal Chem., 2007, 389,1697-1714. 3. http://sitem.herts.ac.uk/aeru/footprint/en/index.htm 4. http://wwwv.m5.ws001.squarestart.ne.jp/foundation/search.html 5. http://www.mrldatabase.com/?selectvetdrug=0 更多信息 如需了解更多有关我们产品和服务的信息,请访问我们的网站www.agilent.com /chem/cn。 HCNWWW.AGILENT.COM/CHEM/SAMPLEPREP:CN 安捷伦样品制备选择指南及应用文集
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