绿茶中乙酰甲胺磷农残检测方案(通用色谱配件)

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食品安全-农药残留分析应用 应用文集 Chen-Hao Zhai 安捷伦科技(中国)有限公司 中国上海英伦路412号， 邮编200131 本应用报告介绍了使用快速、简便、经济、高效、耐用和安全 (QuEChERS)的 EN样品制备方法来萃取和净化绿茶中具有代表性的12种农药。最初的 EN 法包括在缓冲液/乙乙系统中进行的预萃取，加入盐分后的萃取/分配步骤，以及使用分散固相萃取(分散SPE)的样品净化步骤。采用液相色谱-电喷雾电离串联质谱法(LC-ESI-MS/MS)在正离子多反应监测(MRM)模式下测定绿茶提取物中存在的目标农药。并针对所有目标分析物的回收率和重现性进行了方法验证。本应用绿茶中农药的定量限(LOQ)为5ng/g，远低于规定的最大残留限量(MRLs)。回收率实验的加标浓度为10、50和250 ng/g。平均回收率大都在87%~108%范围内(平均值为93.5%)， RSD 低于10%(平均值为5.2%)。 引领分分科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 前言 EN QuEChERS方法已被广泛应用于食品中农药的分析，尤其是在欧洲[1-2]。该方法先用乙腈萃取样品，然后用无水硫酸镁(MgSO)、 NaCl和缓冲柠檬酸盐将样品中的水分盐析出来，形成液液分配。净化过程采用分散固相萃取(分散SPE) 以及N-丙基-乙二胺 (PSA) 羊去样品基质中的有机酸，并用无水MgSO除去萃取物中残留的水分。根据不同的食品基质，可能还会使用不同的净化成分，如使用石墨化碳黑 (GCB)以除去色素和甾醇，或者添加C18以除去脂类和蜡。 由于绿茶含有大量的叶绿素，因而属于高色素样品。因此，本应用选择适用于高色素产品的 EN 分散 SPE 试剂盒。该类试剂盒包含25mg PSA 和150mgMgSO， 适用样品体积为1mL。每毫升乙腈萃取液还应添加 7.5 mg GCB。 GCB 可吸附平面结构分子，如色素和甾醇，因此它有助于净化高色素基质样品，如绿茶。净化 效率取决于 GCB 的用量。 GCB用量越大，可吸附的平面结构分子越多，从而能得到更纯净的样品基质。相对于 AOAC 法中使用相对较多的 GCB (每毫升乙腈萃取液添加50 mgGCB)， EN法中使用的 GCB要低得多(处理“含色素”的样品时，每毫升乙腈萃取液添加 2.5 mg GCB； 处理“高色素”样品时，每毫升乙腈萃取液添加7.5mg GCB)。平面结构农药的萃取率会受到 GCB加入量的影响。AOAC 法可得到更为纯净的样品基质，但易造成平面结构农药的大量损失。与此相反， EN 法几乎不会引起平面结构农药的损失，但得到的样品基质会更为复杂。 本研究采用12种农药评估 Agilent Bond Elut EN 缓冲萃取试剂盒(部件号5982-5650)和用于高色素水果蔬菜的 Bond Elut QuECh-ERS EN 分散 SPE试剂盒(部件号5982-5356)的性能。并对该方法的回收率和重现性进行了验证。表1为绿茶中这些农药的化学结构和相关限量信息。 表1. 农药的化学及限量信息[3-5] MRLs 名称 分类 Log P pKa 结构 (ng/g)* 乙酰甲胺磷 有机磷酸酯 -0.89 8.35 O II 20 HS 胺甲萘 氨基甲酸酯 2.36 10.4 NH 50 0 O 多菌灵 苯并咪唑 1.48 4.2 100 -NH ^N -OCH3 嘧菌环胺 苯氨基嘧啶 4 4.44 N N 500 (接下页) 5990-6400CHCN 引领分分科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 食品安全-农药残留分析应用 MRLs 名称 分类 Log P pKa 结构 (ng/g)* 抑霉唑 咪唑 3.82 6.53 CI /=CH 20 CI- -N N 吡虫啉 新烟碱 0.57 NA N CI N -NO， 1000 NH 戊菌唑 三唑 3.72 1.51 CI、 CI 50 N N 残杀威 氨基甲酸酯 0.14 NA 2000 O、 吡蚜酮 吡啶 -0.19 4.06 600 N、 .NH ^N 0 N 涕必灵 苯并咪唑 2.39 4.73 50 12.00 S N N- 灭线磷 有机磷酸酯 2.99 NA H3CC、 5 O S .CH， H3C N 实验部分试剂和化学品 所有试剂和溶剂均为 HPLC 级或分析级。甲醇 (MeOH) 和乙腈 (ACN)均购自 Honeywell 公司(Muskegon， MI， USA)产品；甲酸 (FA)购自 Fluka公司(Sleinheim，Germany)；农药标准品购自 Sigma- Aldrich 公司(StLouis，MO， USA)；内标物(磷酸三苯酯， TPP) 由 安捷伦科技有限公司(Wilmington， DE，USA)提供。 标准溶液 标准品和内标物 (IS)储备液(除多菌灵为 0.5 mg/mL外，其余均为2.0mg/mL) 另别用 MeOH、0.1%甲酸的乙腈溶液和 DMSO配制， 于-20℃储存。以0.1%甲酸的乙腈/水(1：1) 溶液每天新鲜配制三种QC加标溶液，浓度分别为0.2、1和10pg/mL， 并采用同样的溶剂制备2 pg/mL 的 TPP溶液作为 IS 加标溶液。 仪器和材料 ( Agilent 1200 系列 HPLC (Agilent Technologies Inc.， CA， U S A) 配备电喷雾离子源的 Agilent 6410三重四重杆MS 系统 (Agilent T echnologies Inc.， CA， USA) ) Agilent Bond Elut QuEChERS EN Buffered Extraction缓冲萃取试剂盒，部件号5982-5650；用于高色素水果蔬菜的Bond ElutQuEChERS EN 分散 SPE试剂盒，部件号5982-5356 (AgilentTechnologies Inc.， DE， USA) 安捷伦陶瓷匀质子， 50 mL离心管，部件号 5982-9313 (AgilentTechnologies Inc.， DE， USA) Eppendorf 微型离心机 (Brinkmann Instruments， Westbury， NY，USA) 飞鸽离心机(上海安亭科学仪器厂) 样品制备 样品粉碎 无农药的有机绿茶录自 Teavana 公司。将绿茶装在干净塑料袋， 于-20℃冷冻过夜。时常揉捏袋子以确保茶叶分散。次日，取出所需 与分析物相关的其它条件列于表 2。 量的冰冻茶叶彻底粉碎。可能的话，粉碎时加入干冰。将样品彻底粉碎以得到均质样品。检查最终样品，应无可见的明显茶叶碎片。 提取/分散 称取均质样品2g(±0.1g)， 置于50 mL离心管中。加入100pL适当的 QC标液制成 QC 样品。除空白对照外，所有样品均加入100pL IS 溶液 (10 pg/mL TPP溶液)，使样品溶液中内标物浓度为50 ng/g。离心管加盖，涡旋1 min。后往各离心管中加入8 mL水，加盖，涡旋1 min。然后将 50 mL 离心管的两个陶瓷均质子(部件号5982-9313)加至各离心中中。然后往各离心管中加入10mL乙腈，加盖，振摇1 min。再往各离心管中直接加入 AgilentBond Elut QuEChERS EN 萃取盐包，含4g无水MgS0、1gNaCl、 1g柠檬酸三钠和0.5g柠檬酸二钠盐1.5水合物。盖紧离心管，剧烈振摇20s以确保溶剂与样品充分接触，并使晶体块完全分散。样品管以4000 rpm 的转速离心5 min。 表2. 用于分析12种农药的 LC/MS/MS仪器采集数据 MRM 通道(m/z) CE (V) RT (min) 乙酰甲胺磷 1)184.0>143.0 60 3 1.66 2)184.0>95.1 吡蚜酮 1) 218.1>105.1 125 1.95 2)218.1>78.1 多菌灵 1)192.1>160.1 110 3.25 2) 192.1>132.1 涕必灵 1)202.0>175.1 145 3.37 2)202.0>131.1 吡虫啉 1) 256.1>209.1 125 4.02 256.1>175.1 抑霉唑 2)2 1)297.1>159.0 110 4.40 2)297.1>69.1 残杀威 1)210.2>111.1 70 4.81 2)2210.2>93.1 胺甲萘 1)202.0>145.0 50 4.98 2)2202.0>127.1 1)226.1>93.1 嘧菌环胺 125 5.84 2)226.1>108.1 灭线磷 1)243.1>130.9 125 5.98 2) 243.1>173.0 戊菌唑 1)284.0>70.1 120 6.20 2)284.0>159.0 醚菌酯 1) 314.1>222.1 90 6.62 2) 314.1>235.1 TPP (IS) 1)327.1>77.1 160 6.80 2)327.1>152.1 1) Quantifier transition 通道 2) Qualifier transition 通道 分散 SPE 净化 将6mL乙腈上清液转移至Agilent Bond Elut QuEChERS EN分散SPE 15 mL管(部件号5982-5356) 中， 每个15mL管内含 150 mgPSA、900 mg 无水 MgSO 和 45 mg GCB。 盖紧离心管，涡旋1 min， 再用标准离心机以 4000 rpm 的转速离心5 min。取1mL萃取液转移至10mL试管中， 在低于40℃温度下氮气吹干。残渣用1mL乙腈/水(1/9)复溶，再用 0.45 pm 的滤膜(部件号5190-5085)过滤后进行 LC/MS/MS分析。 结果与讨论 根据推荐，本研究中绿茶处理采用适用于高色素样品的EN分散SPE 试剂盒。采用 EN 法处理的最终样品仍呈现绿色，但是，LC/MS/MS选择性非常强大，空白基质的MRM谱图表明目标分析物无任何干扰峰。图1和图2分别为EN分散SPE 法处理的空白基质(添加 IS) 和加标 50 ng/g 绿茶提取物的 LC/MS/MS谱图。 引领分分科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 应用文集 图1. 绿茶空白基质的 MRM 谱图。峰鉴别： IS： TPP 图2. EN 法处理的加标50 ng/g样品的MRM谱图。峰鉴别：1.乙酰甲胺磷，2.吡蚜酮，3.多菌灵，4.涕必灵，5.吡虫啉，6.抑霉唑，7.残杀威，8.胺甲萘，9.嘧菌环胺，10.灭线磷，11.戊菌唑，12.醚菌酯， IS： TPP 引领分分科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 线性和定量限(LOQ) 所有检测农药的线性校准范围为5-500 ng/g。通过向空白基质加标制成浓度为5、10、50、250和500ng/g的一系列校准曲线溶液，用50 ng/g的 TPP溶液作为内标。通过分析物的相对响应值(分析物峰面积/内标物峰面积)与分析物的相对浓度(分析物浓度/内标物浓度)绘制标准曲线。所有农药的定量限 LOQ 为 5 ng/g， 均低 表3. 绿茶萃取物中农药的线性 名称 回归方程 R2 乙酰甲胺磷 Y=2.0260×+0.0347 0.9995 吡蚜酮 Y=2.3741×-0.0141 0.9999 多菌灵 Y=2.9630×+0.1685 0.9991 涕必灵 Y=1.5021×-0.0034 0.9998 吡虫啉 Y=0.0625×-0.0002 0.9998 抑霉唑 Y=0.9445×+0.0190 0.9997 残杀威 Y=1.8301× +0.0362 0.9998 胺甲萘 Y=0.3677×-0.0014 0.9999 嘧菌环胺 Y=3.0000×+0.0809 0.9991 灭线磷 Y=1.2764×+0.0425 0.9986 戊菌唑 Y=2.7559×+0.0259 0.9999 醚菌酯 Y=0.1976×+0.0119 0.9969 于水果蔬菜中这些农药规定的 MRLs。表3为相应的线性回归方程和相关系数(R2)。 回收率和重现性 通过在粉碎的样品中加入农药标准品对回收率和重现性进行评价，加标浓度分别为10、50和250ng/g。通过空白基质加标绘制的校准曲线进行这些QC样品的定量，每一浓度平行测定六次。回收率和重现性(以RSD 表示) 数据分别见表4和图3。结果显示，11种农药展现出极佳的回收率和精密度。吡蚜酮的回收率较低但精密度良好。这是由于吡蚜酮受 pH的影响较大， 在pH5-5.5范围内，易受提取过程中 pH的影响。多菌灵、涕必灵和嘧菌环胺与吡蚜酮一样都是平面结构的农药，在 d-SPE 阶段，由于使用了少量的GCB， 导致其回收率有所损失。 表4.采用QuEChERS 法测得加标绿茶的回收率和重现性 分析物 QC 加标浓度 10 ng/g QC 加标浓度 50 ng/g QC加标浓度250ng/g 回收率 RSD (n=6) 回收率 RSD (n=6) 回收率 RSD (n=6) 乙酰甲胺磷 80.5% 5.4% 91.7% 2.9% 88.9% 8.2% 吡蚜酮 43.1% 3.0% 42.2% 3.4% 43.4% 9.8% 多菌灵 114.6% 11.6% 97.6% 2.0% 105.0% 6.2% 涕必灵 98.1% 6.9% 90.4% 2.4% 81.7% 5.8% 吡虫啉 104.3% 11.7% 108.6% 2.5% 93.9% 7.9% 抑霉唑 97.5% 4.4% 87.8% 5.6% 92.4% 4.6% 残杀威 98.1% 2.4% 110.2% 1.7% 107.8% 3.9% 胺甲萘 89.7% 11.4% 104.9% 3.3% 108.1% 5.2% 嘧菌环胺 84.9% 2.1% 92.5% 3.7% 93.9% 5.5% 灭线磷 103.4% 3.1% 111.2% 3.2% 104.9% 5.7% 戊菌唑 108.7% 2.9% 94.3% 4.5% 89.8% 3.3% 醚菌酯 105.7% 12.4% 96.4% 2.5% 99.2% 5.5% 图3. 绿茶中12种农药的回收率和精密度结果 引领分分科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 结论 Agilent Bond Elut QuEChERS EN缓冲液萃取试剂盒和用于高色素水果蔬菜的分散 SPE 试剂盒给我们提供了一种简便、快速和高效的用于绿茶中具有代表性农药的净化方法。分散 SPE中使用的少量GCB 基本不影响平面结构农药的萃取。基质加标测得的回收率和重现性表明，该方法可用于绿茶中多类型、多农药残留的测定。 ( 参考文献 ) ( 1. European Committee for r Standardization/Technical Committee C E N/TC 275 (20 0 7)， Foo d s of plant origin：Determination of pesticide residues using GC-MS a n d/orLC-MS/MS following acetonitrile extraction/partitioningand cleanup b y dispersive SPE-QuEChERS m ethod. European Committee for Standardization， Brussels. ) 2. P. Paya，M. Anastassiades；"Analysis of Pesticide ResiduesUsing the Quick Easy Cheap Effective Rugged and Safe(QuEChERS) Pesticide Multiresidue Method in Combinationwith Gas and Liquid Chromatography and Tandem MassSpectrometric Detection"， Anal Bioanal Chem.， 2007， 389，1697-1714. 3. http：//sitem.herts.ac.uk/aeru/footprint/en/index.htm 4. http：//wwwv.m5.ws001.squarestart.ne.jp/foundation/search.html 5. http：//www.mrldatabase.com/?selectvetdrug=0 更多信息 如需了解更多有关我们产品和服务的信息，请访问我们的网站www.agilent.com /chem/cn。 HCNWWW.AGILENT.COM/CHEM/SAMPLEPREP：CN 安捷伦样品制备选择指南及应用文集