血浆中辛伐他汀的药物一致性评价检测方案(液相色谱仪)

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thermoscientific Calibration Curve Parameters for Simvastatin in Human plasma LC-MS/MS 法测定辛伐他汀的药物一致性评价方法学考察 建立一种测定人体血浆中辛伐他汀的 LC-MS/MS 方法，辛伐他汀 d6作为内标，采用乙腈沉淀蛋白，离心后上清液用水复溶的前处理方法。分析柱为 Thermo HypersilGold (100 mm*2.1 mm， 3p)色谱柱，用PH值为4.0的2.00 mM 醋酸铵水溶液与乙腈梯度洗脱。离子源为可加热电喷雾离子源(HESI)，正离子检测，扫描方式为多反应监测(SRM)，辛伐他汀和内标的监测离子对分别为 m/z 436.2→199.1和442.3→199.1。分析时间为5.5 min， 辛伐他汀在0.05-50 ng/mL浓度范围内线性良好。辛伐他汀定量下限为0.05 ng/mL。本方法的灵敏度、精确度和准确度、基质效应、回收率等符合生物样品分析要求，本方法符合法规要求，可以用于药物生物等效性一致性评价的研究。 辛伐他汀； LC-MS/MS；一致性评价 辛伐他汀是由土曲霉内提炼而得，最早是由默克药厂所开发，并于1992年开始进入医疗用途。该药列名于世界卫生组织基本药物清单，属于基础医疗体系必备药物之一作为一种口服降血脂药物，常见商品名“Zoctor”。该品会在运动、节食，和减肥时服用，以避免发生血脂升高。此外辛伐他汀也可降低高心脏病风险者发作的机会。严重副作用包含肌病变、肝脏伤害，以及血糖升高。常见副作用则有便秘、头痛，和恶心。有肾脏问题者宜降低剂量。有证据显示妊娠期间服用该药物会对胎儿造成伤害，哺乳期间不得使用该品。辛伐他汀属于 HMG-CoA 还原酶抑制剂，借此抑制肝脏制造胆固醇。鉴于辛伐他汀的广泛用途，越来越多的生产厂开始生产或仿制辛伐他汀制剂。为了方便进行辛伐他汀的生物等效性一致性评价，本文建立一种灵敏、快速、可靠的 LC-MS/MS检测方法，并按中国药典按照(CFDA)的指导原则进行了方法学验证。 2.实验方法 2.1试剂与样品制备 辛伐他汀(纯度98%)购自 Toronto Research Chemicals，HPLC级甲醇、乙腈购自 Fisher Chemical， 超纯水自制，其他试剂为分析级。 2.2实验用人血浆 购买自 Bioreclamation LLC。 2.3实验仪器 分析仪器为液相色谱串联三重四极杆质谱系统，其中液相色谱为 Vanquish Binary Horizon HPLC， 质谙为 TSQ Quantis ( Thermofisher Scientific)，三重四极杆配有可加热电喷雾离子源。Thermo Hypersil Gold(100mm*2.1mm，3u)为分析柱。 2.4 LC-MS/MS 条件 液相条件：流动相为PH值为4.0的2.00mM 醋酸铵水溶液和乙腈，梯度洗脱，流速为 0.4 ml/min，分析时间为5.5min。 MS/MS条件：喷雾电压为4000V，离子源和离子传输管温度分别为350℃和350℃；碰撞气氩气压力为1.5 mTorr；辛伐他汀和内标的监测离子对分别为 m/z436.2→199.1和442.3→199.1。 2.5储备液配置和标准曲线建立 辛伐他汀的储备液浓度为0.5 mg/mL， 溶剂为乙腈。将辛伐他汀储备液稀液成浓度为12500，2500，125，100，50， 25，5ng/mL的工作溶液。 2.6血浆处理 100mL 空白血浆加入100mL 200mM乙酸铵水溶液，用乙酸调 PH至4.5，备用。 处理后的空白血浆中加入辛伐他汀标准溶液和内标溶液，制备高、中、低质控样品。 2.7方法学验证 通过对比空白血浆、加入内标溶液的空白血浆和加入辛伐他汀配制低质控浓度的血浆样品谱图，计算低质控样品的准确度，考察该方法的专属性。 2.7.2最低定量限 以标准曲线最低浓度点作为质控样品，计算其准确度考察最低定量限。 2.7.3建立标准曲线 取95pL空白血浆，加入5pL辛伐他汀标准工作溶液和内标溶液，经样品前处理后进样分析。分别以辛伐他汀的峰面积与内标峰面积的比值对其浓度作图，用加权最小二乘法进行线性回归，得加权标准曲线。 2.7.4精密度和准确度 高、中、低质控浓度6个样品一日内进样，计算日内精密度和准确度。每个样品连续3日内分别进样分析，计算日间精密度和准确度。 2.7.5回收率和基质效应 血浆样品在沉淀蛋白前和沉淀蛋白后分别加入辛伐他汀标准溶液和内标溶液，计算沉淀前后的比值考察本方法的回收率。在血浆沉淀蛋白后的上清液和60%乙腈水溶液中分别加入辛伐他汀标准溶液和内标溶液，计算两者的比值考察本方法的基质效应。 2.7.6稳定性实验 辛伐他汀储备液、内标储备液、最高与最低两个浓度工作溶液经4℃保存15天，计算4℃保存的溶液与新鲜配制的溶液之间的偏差考察溶液的长期稳定性。 高、低两个质控浓度样品经反复复融、湿冰保存2h和-80℃保存15天、45天，计算质控样品的准确度考察短期与长期稳定性。 经过前处理后的同一序列间隔96h分别进样，考察自动进样器的稳定性。 2.7.7稀释效应 将250 ng/mL辛伐他汀样品用空白血浆稀释10倍。计算准确度考察稀释对样品测定的影响。 2.8高脂血效应 用高脂血浆配制高、低质控样品，计算准确度考察高脂血效应。 2.9序列大小 计算标准曲线与质控样品的准确度，考察一个序列中最大容纳的样品数量。 3.实验结果与讨论 3.1专属性 通过对比空白血浆、加入内标溶液的空白血浆和加入辛伐他汀配制低质控浓度的血浆样品色谱图，并低质控浓度样品的准确度，结果如下。说明血浆中内源性物质对辛伐他汀和内标的检测没有干扰。 空白血浆样品 加入辛伐他汀的低质控浓度血浆样品 Selectivity Data for Simvastatin in Human plasma Matrix ID Theoretical Concentration (0.15 ng/mL) Accuracy (%) Lot1-1 0.162 108.0 Lot1-2 0.172 114.7 Lot1-3 0.165 110.0 Lot2-1 0.149 99.3 Lot2-2 0.161 107.3 Lot2-3 0.144 96.0 Lot3-1 0.157 104.7 Lot3-2 0.145 96.7 Lot3-3 0.186 124.0 Lot4-1 0.162 108.0 Lot4-2 0.170 113.3 Lot4-3 0.147 98.0 Lot5-1 0.140 93.3 Lot5-2 0.171 114.0 Lot5-3 0.204 136.0 n 15 Mean 0.159 SD 0.0104 RSD(%) 6.5 Accuracy (%) 106.0 3.2线性 辛伐他汀在0.05-50 ng/mL浓度范围内线性良好，线性相关系数r均大于0.99. Analysis Group Slope y-Intercept Correlation Coefficient 001 55.64169183 -0.08225152632 0.9956 002 55.01285927 0.294891413 0.9974 003 53.47304402 0.833452586 0.9954 Calibration Curve Data for Simvastatin in Human plasma Theoretical Concentration (ng/mL) Analysis Group 0.05 0.10 0.50 2.0 10.0 25.0 45.0 50.0 001 0.053 *0.120 0.450 2.017 9.469 24.606 44.949 50.751 0.044 0.111 0.480 2.117 10.009 24.802 45.415 52.846 002 0.050 *0.083 0.472 1.872 10.370 24.788 46.422 49.323 0.053 0.089 0.520 1.970 10.407 25.146 45.394 52.321 003 0.046 0.118 0.501 2.104 9.891 24.573 45.424 51.926 *0.034 0.100 0.499 1.869 9.440 25.251 45.054 47.543 n 5 4 6 6 6 6 6 6 Mean 0.0492 0.106 0.485 2.02 10 24.8 45.5 51.4 SD 0.00409 0.0151 0.0269 0.101 0.385 0.228 0.542 1.41 RSD (%) 8.3 14.2 5.5 5.0 3.9 0.9 1.2 2.7 Accuracy (%) 98.4 106.0 97.0 101.0 100.0 99.2 101.1 102.8 * Failed acceptance criteria 3.3最低定量限 辛伐他汀样品的最低定量限为0.05 ng/mL。 Sensitivity Data for Simvastatin in Human plasma Analysis Group Theoretical Concentration (ng/mL) Calculated Concentration (ng/mL) Diff (%) 0.052 4.0 0.057 14.0 001 0.05 0.061 22.0 0.053 6.0 0.053 6.0 0.058 16.0 n 6 Intra-Assay Mean 0.0557 SD 0.00356 RSD (%) 6.4 Accuracy(%) 111.4 0.037 -26.0 0.05 0.054 8.0 0.053 6.0 002 0.042 -16.0 0.05 0.0 0.049 -2.0 n 6 Intra-Assay Mean 0.0475 SD 0.00666 RSD (%) 14.0 Accuracy (%) 95.0 0.042 -16.0 0.034 -32.0 00.3 0.05 0.055 10.0 0.057 14.0 0.056 12.0 0.052 4.0 n 6 Intra-Assay Mean 0.0493 SD 0.00929 RSD (%)18.8 Accuracy (%)98.6 Overall 18 n Inter-Assay Mean 0.0508 SD 0.00742 RSD (%) 14.6 Accuracy (%) 101.6 3.4精密度和准确度 高、中、低浓度质控样品的日间和日内精密度和准确度均小于15%，低浓度小于20%，符合生物样品分析要求。Quality Control Sample Data for Simvastatin in Human plasma Analysis Group Theoretical Concentration (ng/mL) 0.15 Diff (%) 2.50 Diff (%) 37.50 Diff (%) 0.168 12.0 2.542 1.7 41.650 11.1 0.184 22.7 2.408 -3.7 43.271 15.4 001 0.123 -18.0 2.545 1.8 39.711 5.9 0.167 11.3 2.659 6.4 41.425 10.5 0.164 9.3 2.698 7.9 42.934 14.5 0.169 12.7 2.656 6.2 42.339 12.9 n 6 6 6 3.5回收率和基质效应 辛伐他汀低、i中、高质控样品的回收率分别在 98.2%、96%和91.1%，I内标低、中、高质控样品的回收率为90.8%、88.1%和87.3%，说明本实验前处理方法合适。辛伐他汀低、高质控样品经过内标归一化的基质效应分别为 0.981和1.000，说明本方法没有显著的基质效应。 Matrix Factor Data for Simvastatin and the Internal Standard in Human plasma Simvastatin Internal Standard Post Extraction Pure Mean Pure Matrix Post Extraction Pure Mean Pure Matrix ISTD Matrix ID Spike Peak Solution Solution Spike Peak Solution Solution Normalized Factor Factor Area Peak Area Peak Area Area Peak Area Peak Area Matrix Factor Lot1 918.0 1090.0 1111.7 0.826 9930.0 13171.0 13052.7 0.761 1.09 Lot2 789.0 1103.0 0.710 9594.0 12972.0 0.735 0.966 Lot3 756.0 1142.0 0.680 9164.0 13015.0 0.702 0.969 Lot4 827.0 0.744 9502.0 0.728 1.02 Lot5 745.0 0.670 9598.0 0.735 0.912 Lot6 754.0 0.678 9545.0 0.731 0.927 n 6 6 6 Mean 0.718 0.732 0.981 SD 0.0596 0.0188 0.0655 RSD (%) 8.3 2.6 6.7 Lot1 217534.0 304163.0 293171.7 0.742 9578.0 12829.0 12389.0 0.734 1.01 Lot2 218332.0 289525.0 0.745 9133.0 12318.0 0.700 1.06 Lot3 219329.0 285827.0 0.748 9731.0 12020.0 0.746 1.00 Lot4 225575.0 0.769 10225.0 0.783 0.982 Lot5 217642.0 0.742 10051.0 0.770 0.964 Lot6 213755.0 0.729 9500.0 0.728 1.00 n 6 6 6 Mean 0.746 0.744 1.00 SD 0.0131 0.03 0.0325 RSD (%) 1.8 4.0 3.3 3.6稳定性 辛伐他汀储备液、内标储备液、最高与最低两个浓度工作溶液在4℃保存15天的条件下稳定 Solution Stability for Simvastatin Stored at 4℃ for 15 Days Stock Lowest Concentration Highest Concentration Standard Solution Internal Standard Working Solution Working Solution Time 0 Days 15 Days 0Days 15 Days 0 Days 15 Days O Days 15 Days Peak Area Ratio 2.4779 2.3844 0.4036 0.4194 0.0295 0.0271 1.2133 1.1432 Peak Area Ratio 2.4440 2.3874 0.4092 0.4189 0.0293 0.0270 1.2139 1.1494 Peak Area Ratio 2.4665 2.4006 0.4054 0.4166 0.0293 0.0267 1.2178 1.1496 Peak Area Ratio 2.4706 2.4095 0.4048 0.4150 0.0293 0.0264 1.2161 1.1514 Peak Area Ratio 2.4800 2.4077 0.4032 0.4153 0.0296 0.0269 1.2113 1.1506 Peak Area Ratio 2.4865 2.4093 0.4022 0.4151 0.0290 0.0272 1.2157 1.1427 n 6 6 6 6 6 6 6 6 Mean PeakArea Ratio 2.47 2.40 0.405 0.417 0.0293 0.0269 1.21 1.15 Combined Mean 2.44 2.96 -8.2 -4.96 Short-Term Matrix Stability Data for Simvastatin in Human plasmaAfter Storage at -80℃ for 15 Days Theoretical Concentration 0.15 DDiff (%) 37.5 Diff (%) (ng/mL) 0.156 4.0 40.358 7.6 0.161 7.3 40.952 9.2 0.176 17.3 40.714 8.6 0.149 -0.7 35.808 -4.5 0.160 6.7 37.420 -0.2 0.173 15.3 38.238 2.0 n 6 6 Mean 0.163 38.9 SD 0.0103 2.09 RSD(%) 6.3 5.4 Accuracy (%) 108.7 103.7 After Storage at -80℃ for 45 Days Theoretical Concentration 0.15 Diff (%) 37.5 Diff (%) (ng/mL) 0.154 2.7 31.011 -17.3 0.164 9.3 32.960 -12.1 0.164 9.3 34.333 -8.4 0.142 -5.3 34.346 -8.4 0.129 -14.0 30.482 -18.7 0.180 20.0 35.328 -5.8 n 6 6 Mean 0.156 33.1 SD 0.0181 1.96 RSD (%) 11.6 5.9 Accuracy (%) 104.0 88.3 经过前处理后的样品序列在自动进样器中存放96h 稳定性良好。Reinjection Reproducibility Data for Simvastatin in Human plasmaStorage at 4℃ for 96 Hours Theoretical CalculatedConcentration (ng/mL) Concentration (ng/mL) Diff (%) 0.15 0.156 4.0 0.165 10.0 0.166 10.7 0.167 11.3 0.155 3.3 0.170 13.3 Mean 0.163 108.7 2.618 4.7 2.5 2.581 3.2 2.867 14.7 2.730 9.2 2.721 8.8 2.776 11.0 Mean 2.72 108.8 41.46 10.6 37.5 39.806 6.1 40.248 7.3 39.148 4.4 41.733 11.3 40.487 8.0 Mean 40.5 Accuracy (%) 108.0 Original Analysis 3 Reinjection 96 hours Group： Analysis Date： Slope： 53.47304402 Slope： 53.55975644 y-Intercept： 0.833452586 y-Intercept： 1.007984204 Correlation 0.9954 Correlation 0.9957 Coefficient： Coefficient： 3.7稀释效立 3.8高脂血效应 辛伐他汀 250ng/mL浓度样品经10倍体积稀释后测定其准确度和精密度分别为9.9%和3.8%，符合法规要求。 辛伐他汀低、高浓度高脂血样品测定准确度分别为102%和104.8%，符合法规要求 Sample Dilution Analysis for Simvastatin in Human plasma Assessment for the Quantitation of Simvastatin in HyperlipidaemicHuman plasma Theoretical Concentration (ng/mL) 10X Dilution Diff (%) 250 23.807 -90.5 24.004 -90.4 25.778 -89.7 25.394 -89.8 24.139 -90.3 25.858 -89.7 n 6 Mean 24.8 SD 0.947 3.8 RSD (%) Accuracy (%) 9.9 Theoretical Concentration o0.15 (ng/mL) 37.5 (ng/mL) 0.154 39.789 0.147 39.196 0.160 40.651 0.147 37.758 0.154 38.068 0.157 40.528 6 6 Mean 0.153 39.3 SD 0.00527 1.22 RSD (%) 3.4 3.1 Accuracy (%) 102.0 104.8 3.9序列大小 经测定一个序列中最大可容纳192个样品。 4.结论 本文建立了一种灵敏、快速的测定辛伐他汀的 LC-MS/MS方法，经方法学验证本方法的专属性、精密度和准确度、基质效应、回收率和稳定性等符合生物样品分析法规要求，适用于药物生物等效性一致性评价研究。 ThermoFisher SCIENTIFIC 热线话ww.thermofisher.comSCIENTIFIC     建立一种测定人体血浆中辛伐他汀的 LC-MS/MS 方法，辛伐他汀 d6 作为内标，采用乙腈沉淀蛋白，离心后上清液用水复溶的前处理方法。分析柱为 Thermo Hypersil Gold (100 mm*2.1 mm，3μ) 色谱柱，用 PH 值为 4.0 的2.00 mM 醋酸铵水溶液与乙腈梯度洗脱。离子源为可加热电喷雾离子源（HESI），正离子检测，扫描方式为多反应监测（SRM），辛伐他汀和内标的监测离子对分别为 m/z 436.2 → 199.1 和 442.3 → 199.1。 分 析 时 间为 5.5 min，辛伐他汀在 0.05-50 ng/mL 浓度范围内线性良好。辛伐他汀定量下限为 0.05 ng/mL。本方法的灵敏度、精确度和准确度、基质效应、回收率等符合生物样品分析要求，本方法符合法规要求，可以用于药物生物等效性一致性评价的研究。    辛伐他汀是由土曲霉内提炼而得，最早是由默克药厂所开发，并于 1992 年开始进入医疗用途。该药列名于世界卫生组织基本药物清单，属于基础医疗体系必备药物之一 [1] 。作为一种口服降血脂药物，常见商品名“Zoctor”。该品会在运动、节食，和减肥时服用，以避免发生血脂升高。此外辛伐他汀也可降低高心脏病风险者发作的机会。 严重副作用包含肌病变、肝脏伤害，以及血糖升高。常见副作用则有便秘、头痛，和恶心。有肾脏问题者宜降低剂量。有证据显示妊娠期间服用该药物会对胎儿造成伤害，哺乳期间不得使用该品。辛伐他汀属于 HMG-CoA 还原酶抑制剂，借此抑制肝脏制造胆固醇。鉴于辛伐他汀的广泛用途，越来越多的生产厂开始生产或仿制辛伐他汀制剂。为了方便进行辛伐他汀的生物等效性一致性评价，本文建立一种灵敏、快速、可靠的 LC-MS/MS 检测方法 , 并按中国药典按照（CFDA）的指导原则进行了方法学验证。    建立了一种灵敏、快速的测定辛伐他汀的 LC-MS/MS 方法，经方法学验证本方法的专属性、精密度和准确度、基质效应、回收率和稳定性等符合生物样品分析法规要求，适用于药物生物等效性一致性评价研究。