食物和饲料样品中农药残留检测方案(气质联用仪)

智能文字提取功能测试中

实验条件 筛查软件 Dominic Roberts，1 Hans Mol，2Marc Tienstra，2 Cristian Cojocariu，1 and Paul SilcockThermo Fisher Scientific， Runcorn， UK2RIKILT- Wageningen UR， Wageningen， The Netherlands 准确质量；复杂基质； GCOrbitrap质谱；农残分析； QuEChERS；筛查； TraceFinder 软件 前言 全世界都在使用农药来提高作物产量，农药的使用对保证足够的全球食物供应至关重要。然而，对于消费者以及致力于食品安全保障的政府部门来说，如此广泛的农药使用及其在最终产品中残留的可能性，都是心头之患。 因此，法律法规保障消费者不会接触到受农药污染的食物。这些法律法规要求对食物中出现的农药进行种类和数量的监测，并针对具体商品种类给出每种农药允许的最大残留值(MRL)。由于化合物和商品种类组合的数量巨大，给实现准确可靠的常规监测带来很大挑战。 实验室一直在面对不断增长的分析压力，必须以高速度和有竞争力的成本在单次样本分析中实现广谱农药筛查。绝大多数实验室都会借助气相色谱或液相色谱与质谱联用仪器以及定靶分析的策略。这类方法的确能够在较大范围内覆盖需监测的化合物种类并达到所需灵敏度和选择性。然而，它们只局限于目标列表中的化合物，这些化合物通常是根据残留量规定和法律法规的要求来选择的，主要是为了证明被检测的食物样本适合食用。这些定靶分析技术通常需要事先仔细地为每种化合物优化采集参数以及采集时间窗口以确保有效检测。为了扩展分析的视野，近年来使用高分辨全扫质谱法的化合物筛查方法开始受到青睐。 这些筛查方法使用非定靶的分析策略，先运行一个普通的全扫采集，然后再根据所用的数据库进行定靶数据处理。虽然数据分析也是根据目标化合物列表进行的，不过即便并未在数据采集时专门筛查这些未知化合物，仍然可以在数据回溯分析中对未知化合物进行分析。 为使这一方法适用于常规分析，数据筛查处理软件必须足够快足够准，以便达到欧盟指令描述的要求1，在可接受的低假阴性率水平下实现低浓度农残的检出。 虽然对假阳性率没有具体要求，不过常规实验室还是需要保证这个数字尽可能的低，以尽量减少进一步分析所需的时间。 实验室检测的绝大部分样品都是符合法律法规要求的，因此能够快速的区分开符合要求的样品和可能受到污染的样品对实现高效非常重要。在初步的筛查之后，可能的阳性样品会使用另一套确证方法(例如， GC-MS/MS) 进行再分析，以确认是否是阳性结果，并准确测定农残的浓度。确证分析涉及在合适的基质中制备标准曲线等步骤，并不包含在本文描述的筛查方法当中。 在本研究中，我们评估了 Thermo ScientificTM Q ExactiveTM GC组合四极杆-Orbitrap 质谱仪(MS)在准确筛查适合 GC分析的农药时的表现。Q Exactive GC Orbitrap MS 能够提供的质量分辨率高达 120，000 ( m/z 200， 峰高一半处的全峰宽，FWHM)因而能够实现高准确度的质量测定，从而有效地在复杂基质中将被分析物与共流出的等质量数干扰物等杂质分离开。高扫速和单次目标分析物扫描内的高动态范围(>5000)也都有助于从复杂基质中检出痕量化合物。 样品前处理 首先用乙酸缓冲液和基于QuEChERS 方法的提取程序处理食物和饲料样品。简短来说，将10mL酸化的(1%乙酸)乙腈加入5g(早餐麦片或饲料)或10g(水果蔬菜等)均质化的样品中。加入混合盐类，震荡并离心。向最终提取液(0.5或 1 g/mL样品的乙腈溶液)中加入55种农药的混合物，浓度范围为 0.5-100 ng/g(ppb)。我们分析了多种难度较大的基质样品，包括小麦、韭葱，以及马饲料。 仪器和方法设置 全部分析均使用 Thermo ScientificTM Q ExactiveTM GC 组合四极杆-Orbitrap 质谱仪进行。进样使用的是 Thermo ScientificTM TriPlusTMRSH 自动进样器，色谱分离使用 Thermo ScientificTM TRACETM 1310 GC， 色谱柱为 Thermo ScientificTM TraceGOLDTM TG-5SilMS 15m x0.25 mm l.D. ×0.25 pm 薄膜毛细管柱(P/N：26096-1301)。 更多仪器参数及细节参见下表。 TRACE 1310 GC 参数 进样体积(uL)： 1 衬管： 非对称反折型 (P/N： 45352062) 进样口温度(℃)： 75 进样模块及模式： PTV，低温不分流 PTV传输延迟 (min)： 1 进样时间(min)： 0.1 传输速率(℃/sec)： 2.5 传输温度(℃)： 300 PTV 传输时间(min)： 3 清洁速率(℃/sec)： 330 载气及流速(mL/min) ： 氦气，1.2 柱温箱程序 温度1(℃)： 40 保持时间(min)： 1.5 温度2(℃)： 180 升温速率(℃/min)： 25 温度3(℃)： 300 升温速率 (℃/min)： 100 保持时间(min)： 3 质谱仪条件 QExactive 质谱仪参数 传输线温度(℃)： 280 离子化模式： EI 离子源温度(℃)： 230 电子能量(eV)： 70 采集模式： 全扫 质量范围(m/z)： 50-500 质量分辨率(FWHM)： 60，000 锁定质量(m/z)： 207.03235 Q Exactive GC 系统在El全扫模式下运行，分辨率为60，000(FWHM， m/z 200)。此外，还以15K、30K 和 120K等不同分辨率进行了其它实验。色谱数据采集确保不少于每峰11个点，以保证峰面积积分的准确性。 数据处理 数据采集和处理使用Thermo ScientificTM TraceFinderTM软件进行。该软件整合了仪器控制、方法开发等功能，以及定性筛查和定量分析等不同的工作流程。 结果与讨论 本研究的目标是以最高置信度在不同样品基质中大范围筛查多种农药。分析以筛查样品中农药残留是否超过MRL 水平(通常为10 ppb) 为目的。评估方式是通过对不同加标浓度的强化小麦 ( fortified wheat)、马饲料、以及韭葱提取液进行筛查，测定所述条件下所加标样的最低检出浓度。我们选择这些基质样品是由于它们在农残分析中以复杂和具有挑战性而著称，图1所示总离子流谱图也证明了这点。 常规农残分析使用的样品提取方法非常普通(例如QuEChERS)，得到的提取液非常复杂多变。由于样品前处理阶段缺乏选择性，必须在仪器分析过程中进行弥补。提高选择性的方式可以是使用高质量分辨率和高质量精度进行分析。随着样品复杂度的增加，质谱仪的分辨能力对于可靠的农残检测十分关键。分辨能力的重要性在适合 LC的农残分析中已有体现?。此外，高分辨全扫分析无需优化数据采集参数即可扩大分析的视野的特性也十分诱人。 图1.添加了55种农药标品的小麦、马饲料、和韭葱提取液的全扫总离子流谱图(TIC)，由图可见样品的复杂度。 样品通量 样品通量是农残分析当中需要考虑的一个重要因素。因此，我们使用了一个快速色谱方法来测试系统在常规条件下的表现。该色谱方法可以在 17 min之内(两次进样之间)完成一次完整的分析，从而能够在24小时之内完成84次分析。这虽然是一个快速的 GC 方法，质谱仪的高扫速仍然确保了每个色谱峰取到了至少11个点。图2所示为峰宽为1.8秒的二嗪农色谱峰，可见共有11个数据点。 筛查 在以 60，000 质量分辨率进行了全扫分析之后，使用 TraceFinder软件进行数据处理。样品筛查使用一个包含了183种农药的分子式、准确质量、保留时间、同位素峰分布(通过诊断离子的分子式推算)、以及碎片离子等信息的数据库进行。虽然以上所有参数都可以用于鉴定，软件使用的阳性检出关键依据为：主要鉴定离子的提取离子流谱图中在预期出峰时间±20秒窗口内必须有色谱峰，并且测得的离子准确质量必须在理论值±2ppm范围内。同位素峰分布以及碎片离子的保留时间和准确质量。引入这些参数能够提高分析结果的可信度并降低假阳性率。 图2.添加了 10 ng/mL 二嗪农 (m/z 179.11789 ±5 ppm质量窗口)的小麦样品分析的提取离子流图(XIC)，全峰包含11次扫描(峰宽1.8 sec )。数据采集在全扫模式下进行，分辨能力为60，000 FWHM (m/z200)。如图所示，每次扫描的质量准确度和质量差异(ppm)均非常理想，全峰的平均质量差异为 0.3 ppm。 好的数据处理软件是成功执行常规筛查的一个关键。TraceFinder软件能够迅速筛查数据并检测是否存在目标农药。我们使用了一个目标化合物数据库来检测和报告检出的农药，并注明满足了哪些检出标准。图3给出了一个 TraceFinder 浏览窗口样例，图中显示的是在添加了 10 ng/mL 标样的小麦样品中检出的一些农药。农药 p，p'-DDT 的检出和确认是基于保留时间、准确质量数(0.21ppm)、碎片离子、以及同位素分布信息的吻合，，在图中以红色标出。数据以交通信号灯的形式展示在用户面前， 便于快速审阅。更详细的信息可以在总结栏和窗口栏目中查阅，如本样例中的XIC 以及 p，p'-DDT 的理论和实际同位素分布情况。即便是在复杂基质中，本系统也能够提供无与伦比的准确质量数据，使得化合物检出的可信度非常高。所有农药筛查都在<2 ppm 的质量准确度下进行，而如图3所示，实际的质量差异通常只有亚 ppm 水平。对主要的诊断离子和碎片离子来说，准确质量检测都能达到这种水平，从而可以自动筛出假阳性结果或提示用户快速评估。 3 of 9 2 -0.15 萨口 18 Bof 9 2 MZ RT IP FI Flag m/z (Delta (ppm)) Isotopic Pattemn Score (%) RT(Expected) RT (Measured) Fragment 1(Delta (ppm)) Num Isotopes Matched -0.06 of 8 2 可 Aa y Aa a 0.79 0 0.37 100 7.86 0.45 1 of 9 2 21 0.37 0.47 100 100 22 0.45 23 100 100 0.47 -0.26 0.5 9of 11 2 24 6.60 5.79 6.93 6.60 100 100 8.90 8.90 0.13 -0.01 7.97 of 8 2 of 3 0.15 9.50 9.56 04 of 3 0 0.21 100 100 B of9 -032 Chromatogram Spectrum 0 #7：239.01135 Isotopes 100%(8 of 8) ● Fragments (2 of2) AllIsotopes @ Multi-Isotopes #1：235.00758 #2：236.01094 0#3：237.00463 图3.添加了10 ng/mL 标样的小麦样品中检出的农药(以 p，p'-DDT 为例)在 TraceFinder 筛查浏览器中显示界面。农药检出的确认是基于准确质量确认(±2 ppm 质量窗口)、保留时间(RT)、同位素峰分布(IP)、和碎片离子(FI)信息的吻合。红色方框提示的是主要离子和确证离子检测的亚 ppm 水平质量准确度。 低于 MRL 水平的筛查 在本研究中，当加标浓度为 10 ng/mL时，所有55种农药都在小麦、马饲料、和韭葱样品中成功检出。不仅如此，绝大多数农药都可以在更低的浓度被检出。如图4和5所示，在小麦基质中，53种农药均可在<2.5 ng/mL 浓度水平下检出，而在加标水平降低至0.5 ng/mL时，仍有47种农药可被检出。这种在复杂基质中也可以达到的无可比拟的灵敏度能够有效支持在MRL 规定的浓度水平甚至更低水平实现可信筛查，这也成为 Q Exactive GC 系统的一个独特特性。 图4.小麦中55种农药的最低检出标样浓度图。鉴定基于准确质量差异<2 ppm 和保留时间差异不超过20秒。红圈为5 ng/mL 浓度水平。 图5.马饲料中55种农药的最低检出标样浓度图。鉴定基于准确质量差异<2 ppm 和保留时间差异不超过20秒。 [图中强调了 5 ng/mL 和 10 ng/mL 浓度水平。 只有当分辨能力足以将目标化合物与基质干扰和其它目标化合物区分开来时，使用较低的质量准确度容忍度才成为可能。当两个质量轮廓图重合时，测得的质量轮廓实际是两者之和，导致目标化合物的质量测定不准确。图6显示的正是这一现象。该实验分别以15K、30K、60K 和 120K 分辨率对韭葱样品进行了分析。 质谱图中可见一个氯苯胺灵的诊断离子，以及一个质量相近的背景基质离子对其造成干扰。在 60K 和120K分辨 率下，分析可达到预期的质量准确度，实现基线分离。然而在15K 和30K分辨率时，氯苯胺灵未能与干扰离子实现分离，降低了质量准确度。尤其是在 15K 分辨率下，质量准确度受到严重影响，质量差异高达 18.4 ppm。按照本研究使用的筛查标准，即便将质量差异容忍度进一步放宽到 10 ppm， 仍然会造成氯苯胺灵的假阴性结果。这些试验结果说明高于60，000的质量分辨能力是必须的，而这个最低分辨能力的具体值则取决于样品的复杂度以及目标化合物和干扰物的浓度。 图6.分辨能力会影响基质中被分析物的质量准确度。在15K、30K、60K和120K质量分辨率下采集的韭葱提取液中，10 ng/mL 氯苯胺灵的一个离子的质谱图。15K 和 30K 分辨率不足以分开氯苯胺灵离子与基质干扰峰，导致质量精确度变差。在 15K分辨率时，按照本研究的筛查标准，该农药会不能检出，导致假阴性结果。 图7.在 TraceFinder 软件中查看韭葱中丁苯吗啉的提取离子流谱图和校准曲线。校准样品进行了三次平行重复进样，线性良好。 农药定量分析表现 在常规分析中，接下来应该对样品中检出的农药进行定量分析。我们在0.5-50 ng/mL 浓度范围内，用基质匹配过的样品评估了农药检测的线性，每个校准标品重复分析三次。在所有情况下，决定系数(R?)均>0.99，平均值为 R?= 0.997，回归残差<25%。 图7以丁苯吗啉为例给出了化合物定量校准曲线。检出化合物的完整定量流程不在本研究讨论范围内，不过在 Thermo Scientific应用文献104493中有详细描述。 ( 本次评估的结果显示， Therm o Scientific Q Exactive GC组合 四极杆-Orbitrap 质谱仪佐以 TraceFinder 软件，对于食品和饲料的常规农残筛查来说是一套极其有效的工具。Orbitrap 质谱仪的分辨能力、质量准确度和灵敏度都非常出色。 ) ( 。使用高分辨全扫质谱分析进行筛查是扩大分析范围的有效方法，凭借该技术，无需提前进行采集参数优化即可在单次实验中分析更多的化合物。 ) ( 。快速GC分析和采集速率提高了实验室的分析效率和样品通量。超群的质量精确度再加上极高的灵敏度，使得可靠的常规农残筛查成为可能。 ) ·以60，000 FWHM(m/z 200)的质量分辨率进行数据采集能够消除同质量化合物的干扰，提高在复杂基质中筛查农药的结果可信度。对所有化合物都持续提供亚 ppm 水平的质量精度，确保化合物鉴定结果可信。 ( 参考文献 ) ( 1.SANCO/12571/2013. Method va l idation a n d qualitycontrol procedures for p esticides r esidue analysis i n food and feed. ) ( 2. Kellmann， M.， Muenster， H . ， Zomer， P . & Mol，H.(2009) F ull Scan M S in C o mprehensive Qualitativeand Q uantitative Residue A nalysis in Food a nd F eedMatrices： H ow Much Resolving Power is Required?J AmSoc Mass Spectrom， 20，1464-1476. ) ( 3. Thermo S c ientific A pplication Note e 1 10449： Fast screening， identification， and quantification of pesticideresidues i n baby food u sing GC Orbitrap M S technology.Runcorn， UK. ) ThermoSCIENTIFIC SCIENTIFIC全国服务热线： 支持手机用户)AThermo Fisher Scientific BrandAN C_GCMSMS_ 我们评估了 Thermo ScientificTM Q ExactiveTM GC 组合四极杆-Orbitrap 质谱仪（MS） 在准确筛查适合 GC 分析的农药时的表现。Q Exactive GC Orbitrap MS 能够提供的质量分辨率高达 120,000（m/z 200，峰高一半处的全峰宽，FWHM） ，因而能够实现高准确度的质量测定，从而有效地在复杂基质中将被分析物与共流出的等质量数干扰物等杂质分离开。高扫速和单次目标分析物扫描内的高动态范围（> 5000）也都有助于从复杂基质中检出痕量化合物。