多肽中分离检测方案(液质联用仪)

智能文字提取功能测试中

使用 Agilent AdvanceBio PeptidePlus 色谱柱进行可重现的LC/MS多肽分离 应用简报 生物治疗药物和生物仿制药 作者 前言 Suresh Babu C.V. 安捷伦科技公司 多肽分离是生物药物表征过程中至关重要的一步。肽谱分析在药品开发中作为主要的质量控制 (QC)步骤，其中包括通过酶解生成多肽片段，然后进行反相分离和质谱鉴定。由于蛋白质混合物的蛋白水解消化物固有的复杂性，高效、高分离度的多肽分离显得尤为重要。保留时间和峰面积/峰高等肽谱分析的质量属性是获得可靠肽谱分析结果的关键。因此，需要采用稳定可重现的 LC/MS 方法严格表征多肽片段，从而可靠地评估分析结果。 本研究证明，使用可兼容质谱的 Agilent AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱以及含甲酸改性剂的流动相可实现高效的多肽分离。本研究筛选了多种类型的样品用于评估多肽分离的色谱柱性能。结果表现出优异的保留时间、峰面积、峰高和半峰宽 (FWHM)重现性。 Agilent Technologies 材料与方法 结果与讨论 样品 ·HHSA 多肽标准品 (G2455-85001) 十肽标准品 (5190-0583) ·nmAb 胰蛋白酶酶解物 液相色谱系统 图1A 和 1B显示了两种不同多肽准品混合物的 LC/MS分离。所选的多肽序列由不同长度和质量的氨基酸残基构成，因此适合评估色谱柱性能。结果表明了多肽标准品获得了高效的基线分离。这款色谱柱具有出色的 TIC峰形， FWHM 小于0.16 min。使用甲酸作为流动相改性剂，获得了较窄的 TIC 峰宽。 RSD 值体现出该 LC/MS 方法的稳定性。 Agilent 1290 Infinity lI 液相色谱仪 质谱系统 Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF 仪器条件 参数 值 色谱柱 Agilent AdvanceBio Peptide Plus 2.1×150 mm， 2.7 pm， 120A (部件号675950-902) 流动相 A) 0.1%甲酸的水溶液 B) 0.1%甲酸的乙腈溶液 柱温 55°C 梯度 30 min 内 B 由3%升至40% 流速 0.5 mL/min 电离模式 正离子模式，双 AJS ESI 干燥气温度 325°C 干燥气流速 13 L/min 鞘气温度 275°C 鞘气流速 12 L/min 雾化器压力 35 psi 毛细管电压 4000V 碎裂电压 175V 锥孔电压 65V Oct RF Vpp 750 V 数据分析 Agilent BioConfirm 软件 B.08 峰归属 1.缓激肽片段1-7 2.缓激肽 3.血管紧张素Ⅱ(人类) 4.神经降压素 ×108 A 5 7 5.血管紧张素1(人类) 3 6 8 6.肾素底物(猪) 7. [Ace-F-3，-2H-1]血管紧张肽原(1-14) 10 8.丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(15-31) 9. [F14]丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(15-31) 4 10.蜂毒肽(蜜蜂毒液) 4 2 %RSD 9 RT 峰面积峰高 FWHM 3 峰1 0.17 2.03 1.65 0.44 峰2 0.10 1.08 0.96 0.48 峰3 0.07 0.85 0.66 0.00 1 2 峰4 0.05 0.77 0.47 0.65 峰5 0.06 0.82 0.77 0.00 峰6 0.04 0.42 0.49 0.55 峰7 0.05 0.50 0.80 0.50 峰8 0.03 1.49 0.73 0.63 峰9 0.02 2.54 1.02 1.25 峰10 0.08(0.52 1.06 1.26 0 12131415 2223 采集时间(min) 采集时间(min) 图1.使用 Agilent AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱分析多肽标准品混合物(五次重复进样)得到的总离子流叠加色谱图。 A)安捷伦十肽标准品(部件号5190-0583)， B)安捷伦 HSA 多肽标准品(部件号 G2455-85001) 图2显示了四种不同 mAb 的 LC/MS肽谱分离。本研究选择多种 mAb 制剂研究色谱柱性能和 LC/MS 方法的稳定性。结果表明多组肽谱得到了出色的多肽分离，峰形得到改善。重复进样获得的色谱图未观察到明显的漂移现象。 RSD 值证明了色谱柱和LC/MS 方法的稳定性。 峰1 RT 峰面积峰高 0.51 高FWHM 峰1 0.22 4.48 4.42 1.71 3.82 峰2 0.09 1.86 1.17 1.39 0.79 峰3 0.04 7.63 2.42 0.78 2.02 峰4 0.13 4.78 2.03 0.85 2.04 峰5 0.07 0.81 0.29 0.66 0.00 峰6 0.01 4.68 1.91 4.33 0.87 峰7 0.03 7.06 3.65 0.53 1.53 峰8 0.04 3.71 3.48 0.95 1.79 峰9 0.03 6.31 7.21 4.43 采集时间 (min) 图2. 使用 Agilent AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱分析 mAb 胰蛋白酶肽谱(五次重复进样)的总离子流叠加色谱图 结论 本研究表明： 使用甲酸流动相改性剂和 Agilent AdvanceBio PeptidePlus 色谱柱可实现高效的 LC/MS 多肽分离 具有出色的保留时间、峰面积、峰高和峰宽重现性 更多信息 这些数据仅代表典型的结果。有关我们的产品与服务的详细信息，请访问我们的网站 www.agilent.com。 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 仅限研究使用。不可用于诊断目的。 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本资料中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 @ 安捷伦科技(中国)有限公司，2017 2017年5月10日，中国出版 5991-8067CHCN 前言多肽分离是生物药物表征过程中至关重要的一步。肽谱分析在药品开发中作为主要的质量控制 (QC) 步骤，其中包括通过酶解生成多肽片段，然后进行反相分离和质谱鉴定。由于蛋白质混合物的蛋白水解消化物固有的复杂性，高效、高分离度的多肽分离显得尤为重要。保留时间和峰面积/峰高等肽谱分析的质量属性是获得可靠肽谱分析结果的关键。因此，需要采用稳定可重现的 LC/MS 方法严格表征多肽片段，从而可靠地评估分析结果。本研究证明，使用可兼容质谱的 Agilent AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱以及含甲酸改性剂的流动相可实现高效的多肽分离。本研究筛选了多种类型的样品用于评估多肽分离的色谱柱性能。结果表现出优异的保留时间、峰面积、峰高和半峰宽 (FWHM) 重现性。结论本研究表明：• 使用甲酸流动相改性剂和 Agilent AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱可实现高效的 LC/MS 多肽分离• 具有出色的保留时间、峰面积、峰高和峰宽重现性