食品模拟物中双酚A检测方案(液相色谱仪)

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Mary Angela Favaro Perez、 Marisa Padula、 Jozeti Gatti 和 Patricia Cristina de Lima 食品技术研究院 巴西圣保罗州坎皮纳斯 Daniela Daniel 安捷伦科技公司 使用 UHPLC-MS/MS 与带荧光检测器的液相色谱评估双酚A从包装材料到食品模拟物的特定迁移 应用简报 摘要 双酚 A(2，2-二(4-羟基苯基)丙烷)，也就是 BPA， 主要用于生产环氧树脂，用作食品和饮料罐内表面和外表面的涂层材料。此外，BPA还用来生产聚碳酸酯树脂。目前已经确定 BPA 是一种内分泌干扰物，全球各大健康职能部门对其进行了评估。这些监管机构确认使用 BPA是安全的，但禁止将 BPA用于一岁以内婴儿用奶瓶中。BPA允许用于其他产品中，具体的限值为在1 kg食品中迁移 0.6mg。食品包装材料必须满足该限值。为确认是否符合法规要求，本研究使用带荧光检测器的液相色谱或 UHPLC-MS/MS 检测食品模拟物中BPA 的特定迁移(SM)。本研究旨在验证使用上述两种设备检测食品模拟物中 BPA 特定迁移的方法有效性。对于水性模拟物，使用UHPLC-MS/MS得到的检测限(LOD)要比 HPLC-FL 的 LOD 低10-30倍，对于相同模拟物，使用UHPLC-MS/MS 得到的定量限 (LOQ)则比 HPLC-FL 大约低10倍。对于脂肪模拟物，使用UHPLC-MS/MS得到的 LOD 比 HPLC-FL低近5倍， LOQ则要低2.4倍。UHPLC-MS/MS的特异性及其出色的 LOD 和 LOQ证明其能够有力支持食品中 BPA 迁移的深入研究以确定消费者暴露量，并帮助健康职能部门监测食品中的 BPA。 环氧树脂涂层对基质的粘附性强、灵活性高、耐化学腐蚀性好，因此被广泛用于食品和饮料罐等产品。环氧丙烯酸酯树脂水性清漆是铝合金软饮两片罐最常用的清漆。环氧胺树脂清漆用于甜炼乳钢制三片罐，而环氧酚醛树脂清漆则用于奶油、番茄产品以及灌装玉米和豌豆的钢制三片罐。由于 BPA 会影响人体健康，已确认为内分泌干扰物，目前EFSA、FDA、加拿大卫生部以及 ANVISA等健康监管部门对其进行了评估。这些监管机构确认使用BPA是安全的，但禁止将 BPA 用于一岁以内婴儿用奶瓶中。BPA 可用于其他应用，欧洲、南方共同市场及巴西的相关法规规定在1 kg食品中的特定迁移限值为0.6 mg[1，2，3]。因此，食品包装必须满足此限值要求。为确认是否符合法规要求，本研究检测了几种食品模拟物的特定迁移 (SM)，这几种模拟物分别代表了不同类型的食品。蒸馏水、乙酸溶液 (3%w/v)、乙醇溶液 (50%v/v)以及橄榄油分别代表水、酸、酒精及乳制品和脂质食品[4]。 将欧洲标准化委员会开发的方法 CEN/TS 13130-13：2005 [5]用作测定双酚A特定迁移的参考方法，该方法采用带荧光检测器的 HPLC进行。不过据文献报道，对于检测食品模拟物中的BPA， 荧光检测器是一种高效手段，但检测食品中的该单体，或是确证食品或食品模拟物中是否存在该单体，则需要液质联用系统。想确定BPA对消费者的暴露量，首先得知道该物质在食品中的含量。 本研究旨在验证食品中BPA 特定迁移量的两种检测方法： UHPLC-MS/MS和带荧光检测器的HPLC， 通过比较这两种方法获得的结果来得出结论。 实验部分 UHPLC-MS/MS 液相色谱条件 仪器 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统 色谱柱 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18， 2.1mmx50 mm， 1.8 um (部件号959757-902) 柱温 30°℃ 进样量 10pL 流动相 甲醇：0.1%乙酸水溶液 (70：30/v：v)， 等度洗脱 流速 0.3 mL/min 质谱条件 仪器 Agilent 6400 系列三重四极杆液质联用系统 离子模式 AJS-ESI，负离子化 毛细管电压 3500 V 干燥气流速(N，) 10 L/min 干燥气温度 250°C 雾化气压力 45 psi 鞘气温度 300°C 鞘气流速 10 L/min HPLC-荧光 液相色谱条件 仪器 Agilent 1200 Infinity 系列 色谱柱 Agilent 100 RP 18e (Lichrospher) 4.0 mm x250 mm， 5pm (部件号799250DE-584)柱温 30℃进样量 50pL流动相 水性模拟物：甲醇：水(70：30/v：v)脂肪模拟物：甲醇：甲(60：40/v：v)；等度洗脱流速 1.0 mL/min荧光条件仪器 Agilent 1200 Infinity 系列发射波长 275 nm 表1列出了用于监测双酚A的离子。响应强度最高的离子对作为定量离子 (m/z 133)， 强度次高的离子对作为定性离子(m/z211.1)，进行确证分析 表1.所选化合物的保留时间和MRM条件 RT (min) (m/z) (m/z) (ms) (V) (V) 1.0 227.1 211.1 200 139 24 4 166.8 52 133 24 依据 INMETRO DOQ-CGCRE-008中的方法[6]，检测限(LOD)和定量限 (LOQ)的确定方法为：将相同浓度的不同溶液进样7次(质谱检测器的进样浓度为80 pg/L， 荧光检测器的进样浓度为 188 pg/L)。采用四种食品模拟物：蒸馏水、乙酸溶液 (3%w/v)、乙醇溶液 (50%v/v)和橄榄油确定检测限。 根据迁移检测结果决定回收率测定的样品前处理方法[4]。将加标了分析物(水性模拟物：90、600和 1200 pg/L，脂肪模拟物：300、600和1200 pg/L) 的样品一式三份于40°℃下放置10天，模拟室温下食品与包装材料长时间接触的过程。然后将样品用于分析。本实验使用了四种模拟物。 连续六次重复进样浓度为 0-6000 pg/L的标准溶液，测得水性和脂肪模拟物的线性。 结果与讨论 LOD 和 LOQ 表2和表3分别列出了使用 UHPLC-MS/MS 和 HPLC-荧光检测器获得的 LOD 和 LOQ结果。对于水性模拟物，使用UHPLC-MS/MS 得到的 LOD 要比 HPLC-FL的LOD 低2.6-30倍，对于相同模拟物， UHPLC-MS/MS 的 LOQ则比HPLC-FL低大约10倍。对于脂肪模拟物， UHPLC-MS/MS得到的 LOD 比 HPLC-FL得到的低近5倍， LOQ则比 HPLC-FL得到的低2.4倍。 表2.2.使用 UHPLC-MS/MS 测得的 LOD 和LOQ 模拟物 LOD (pg/L) L0Q (pg/L) 蒸馏水 0.76 4.33 3% w/v乙酸水溶液 0.20 3.57 50%v/v乙醇水溶液 0.95 4.41 橄榄油 4.40 95.7 表3.3.使用HPLC-荧光检测器测得的 LOD 和 LOQ 蒸馏水 5.4 43.6 3%w/v乙酸水溶液 6.2 38.5 50% v/v乙醇水溶液 2.5 34.3 橄榄油 20.7 227.9 回收率 表4和表5分别列出了使用 UHPLC-MS/MS 和 HPLC-FL 获得的回收率结果。根据 Huber 的报道，浓度在 300-1200 pg/L的样品，其可接受的回收率范围为 80-110%，对浓度为90 pg/L样品，可接受的回收率范围为 60-115%[7]。 表4.4.使用 UHPLC-MS/MS 测得的回收率 参比浓度 实验浓度* 回收率百分比 模拟物 (pg/L) (pg/L) 标准偏差 (40°C/10天后) 蒸馏水 90 103 0.01 115 3% w/v乙酸水溶液 64 0.01 71 50% v/v乙醇水溶液 101 0.01 112 橄榄油 300 330 0.01 110 蒸馏水 601 0.05 100 3%w/v乙酸水溶液 600 490 0.04 82 50%v/v乙醇水溶液 552 0.10 92 橄榄油 544 0.11 91 蒸馏水 1109 0.08 92 3%w/v乙酸水溶液 1200 992 0.13 83 50%v/v乙醇水溶液 1233 0.21 103 橄榄油 1124 0.11 94 表5.使用HPLC-荧光检测器测得的回收率 参比浓度 实验浓度* 回收率百分比 模拟物 (pg/L) (pg/L) 标准偏差 (40°C/10天后) 蒸馏水 90 91 0.01 101 3% w/v乙酸水溶液 74 0.01 82 50%v/v乙醇水溶液 92 0.01 102 橄榄油 300 300 0.03 100 蒸馏水 0.02 104 3% w/v乙酸水溶液 600 0.04 98 50% v/v 乙醇水溶液 530 0.07 88 橄榄油 520 0.12 87 蒸馏水 1070 0.03 89 3% w/v乙酸水溶液 1200 1136 0.11 95 50%v/v乙醇水溶液 1059 0.21 88 橄榄油 1125 0.17 94 *三次测定平均值 线性及校准曲线 使用六个浓度水平的标准溶液研究分析曲线的线性，对于水性模拟物浓度范围为 0-300 pg/L、300-6000pg/L，对于脂肪模拟物则为 0-6000 pg/L。 对 UHPLC-MS/MS 和 HPLC-FL 两个系统得到的 BPA 浓度值进行线性回归，得到的相关系数(R2)均大于 0.996。根据标准方法 CEN/TS13130-13：2005， R2的值需大于0.99[5]。图1是使用UHPLC-MS/MS测得的水性模拟物中BPA的校准曲线示例。 图1.双酚A校准曲线。A)蒸馏水模拟物(300-6000pg/L)； B) 蒸馏水模拟物(0-300 pg/L)； C) 3% w/v乙酸水溶液模拟物(300-6000pg/L)；D) 3% w/v乙酸水溶液模拟物(0-300 pg/L) 表6和表7汇总了所有模拟物的相关系数(R2)。 表6. 使用 UHPLC-MS/MS 测得的相关系数 图2是3% w/v乙酸水溶液中 600 pg/L双酚A的MRM色谱图。 模拟物 (0-300 pg/L) (300-6000 pg/L) 蒸馏水 0.999 0.999 3% w/v乙酸水溶液 0.998 0.999 50% v/v乙醇水溶液 0.998 0.999 表7.使用UHPLC-荧光检测器测得的相关系数 模拟物 (0-300 pg/L) (300-6000 pg/L) 蒸馏水 0.999 0.997 3%w/v乙酸水溶液 0.991 0.999 50% v/v乙醇水溶液 0.991 0.999 图2.3%乙酸水溶液模拟物中双酚A的UHPLC-MS/MS 色谱图 结论 本文中验证的方法可用于研究塑料材料及清漆中的双酚A的特定迁移，这些材料通常用作食品模拟物罐的内表面涂层。使用 UHPLC-MS/MS 方法分析 BPA 需要2分钟，而使用带荧光检测器的 HPLC则需要7分钟(水性模拟物)或12分钟(脂肪模拟物)。方法的灵敏度也足以满足南方共同市场[2]和欧盟法规对 BPA 限值的规定[1]。本研究使用的方法简单、快速、校准曲曲线性良好，BPA回收率在预期范围内。UHPLC-MS/MS 的特异性及其出色的LOD 和 LOQ证明其能够有力支持 BPA 迁移的深入研究以确定消费者暴露量，并帮助健康职能部门监测食品中的BPA。 ( 参考文献 ) 1.COMISSAO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS.Regulamento (UE) N' 10/2011， de 14 de Janeiro de 2011.Relativo aos materiais e objectos de materia plasticadestinados a entrar em contacto com os alimentos.Jornal Oficial da Uniao Europeia， Bruxelas， L 12，15 Jan. 2011.89 p. 2. GRUPO MERCADO COMUN. Mercosur/GMC/Res.n°02/12.Regulamento Tecnico Mercosul sobre a listapositiva de monomeros， outras substancias iniciadoras epolimeros autorizados para a elaboracao de embalagense equipamentos plasticos em contato com alimentos(Revogacao das Res. GMC n' 47/93，86/93，13/97，14/97 e24/04). Buenos Aires， 19 abril 2012. 3. BRASIL.Ministerio da Saude.Agencia Nacional deVigilancia Sanitaria. Resolucao RDC n° 56， de 16 denovembro de 2012.Dispoe sobre a lista positiva demonomeros， outras substancias iniciadoras e polimerosautorizados para a elaboracao de embalagens eequipamentos plasticos em contato com alimentos.Diario Oficial [da] Republica Federativa do Brasil.Brasilia， DF， 21 nov. 2012.Secao 1， p. 66-77. 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： 4. BRASIL.Ministerio da Saude -Agencia Nacional deVigilancia Sanitaria. Resolucao-RDC n°51 de 26 denovembro de 2010.Dispoe sobre migracao em materiais，embalagens e equipamentos plasticos destinados aentrar em contato com alimentos.Diario Oficial [da]Republica Federativa do Brasil， Brasilia， DF， 30 nov.2010.Secao 1， n.228， p. 105-109. 5. EUROPEAN COMMITEE FOR STANDARDIZATION -CEN/TS 13130-13 Materials and articles in contact withfoodstuffs - Plastics substance subject to limitation - Part13： Determination of 2，2-bis(4-hydroxyphenyl) propane(Bisphenol A) in food simulants. February 2005. p. 1-13 6. lNMETRO.Coordenacao Geral de Acreditacao.D0Q-CGCRE-008： orientacao sobre validacao de metodosanaliticos. Rio de Janeiro， jul. 2011.19 p. Revisao n’ 04. 7. HUBER. Ludwig：Validation o老f analytical methods andprocedures. 该参考文献可通过以下网站获取：http：//www.labcompliance.com/tutorial/methods.发布时间：2014年3月27日 更多信息 有关我们的产品与服务的详细信息，请访问我们的网站www.agilent.com。 www.agilent.com 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本资料中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 C Agilent Technologies， Inc. 2014 2014年8月21日， 中国出版 5991-5037CHCN Agilent Technologies     摘要    双酚A（2,2-二(4-羟基苯基)丙烷），也就是BPA，主要用于生产环氧树脂，用作食品和饮料罐内表面和外表面的涂层材料。此外，BPA 还用来生产聚碳酸酯树脂。目前已经确定BPA 是一种内分泌干扰物，全球各大健康职能部门对其进行了评估。这些监管机构确认使用BPA 是安全的，但禁止将BPA用于一岁以内婴儿用奶瓶中。BPA 允许用于其他产品中，具体的限值为在1 kg 食品中迁移0.6 mg。食品包装材料必须满足该限值。为确认是否符合法规要求，本研究使用带荧光检测器的液相色谱或UHPLC-MS/MS 检测食品模拟物中BPA 的特定迁移(SM)。本研究旨在验证使用上述两种设备检测食品模拟物中BPA 特定迁移的方法有效性。对于水性模拟物，使用UHPLC-MS/MS得到的检测限(LOD) 要比HPLC-FL 的LOD 低10-30 倍，对于相同模拟物，使用UHPLC-MS/MS 得到的定量限(LOQ) 则比HPLC-FL 大约低10 倍。对于脂肪模拟物，使用UHPLC-MS/MS 得到的LOD 比HPLC-FL 低近5 倍，LOQ 则要低2.4 倍。UHPLC-MS/MS 的特异性及其出色的LOD 和LOQ 证明其能够有力支持食品中BPA 迁移的深入研究以确定消费者暴露量，并帮助健康职能部门监测食品中的BPA。    前言    环氧树脂涂层对基质的粘附性强、灵活性高、耐化学腐蚀性好，因此被广泛用于食品和饮料罐等产品。环氧丙烯酸酯树脂水性清漆是铝合金软饮两片罐最常用的清漆。环氧胺树脂清漆用于甜炼乳钢制三片罐，而环氧酚醛树脂清漆则用于奶油、番茄产品以及灌装玉米和豌豆的钢制三片罐。由于BPA 会影响人体健康，已确认为内分泌干扰物，目前EFSA、FDA、加拿大卫生部以及ANVISA 等健康监管部门对其进行了评估。这些监管机构确认使用BPA 是安全的，但禁止将BPA 用于一岁以内婴儿用奶瓶中。BPA 可用于其他应用，欧洲、南方共同市场及巴西的相关法规规定在1 kg 食品中的特定迁移限值为0.6 mg[1,2,3]。因此，食品包装必须满足此限值要求。   为确认是否符合法规要求，本研究检测了几种食品模拟物的特定迁移(SM)，这几种模拟物分别代表了不同类型的食品。蒸馏水、乙酸溶液(3% w/v)、乙醇溶液(50% v/v) 以及橄榄油分别代表水、酸、酒精及乳制品和脂质食品[4]。将欧洲标准化委员会开发的方法CEN/TS13130-13:2005 [5]用作测定双酚A 特定迁移的参考方法，该方法采用带荧光检测器的HPLC 进行。不过据文献报道，对于检测食品模拟物中的BPA，荧光检测器是一种高效手段，但检测食品中的该单体，或是确证食品或食品模拟物中是否存在该单体，则需要液质联用系统。想确定BPA 对消费者的暴露量，首先得知道该物质在食品中的含量。    本研究旨在验证食品中BPA 特定迁移量的两种检测方法：UHPLC-MS/MS 和带荧光检测器的HPLC，通过比较这两种方法获得的结果来得出结论。