饲料中莱克多巴胺检测方案(固相萃取仪)

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Preekem屹尧科技 样品前处理专家 网址：www.preekem.com 邮箱： info@preekem.com本资料中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知! 农、林、牧、渔行业解决方案 一 完整的无机和有机样品前处理产品线提供全面的制药化妆品检测解决方案 无机样品前处理系列 微波消解仪一适用于重金属及汞、砷等有害物质元素检测 TOPEX全能型微波化学工作平台 WX-8000专家型密闭微波消解仪 COOLPEX 灵动型微波化学反应仪 有机样品前处理系列 适用于农药残留、兽药残留、食品添加剂、药物及司法检测 |EXTRAAK全自动固相萃取仪 N1全自动氮吹浓缩仪 FLEXI-ONE凝胶净化色谱仪 β-兴奋剂是从天然儿茶酚胺衍生合成的一类化合物。在动物日粮中添加β-兴奋剂可以提高饲料转化率和增加瘦肉率。莱克多巴胺(Ractopamine)是苯乙醇胺类β-受体激动剂(结构式见图1)，可促进动物体内脂肪向蛋白质转化，表现出营养再分配效应，是β-兴奋剂中唯一被美国 FDA 批准应用于提高食品动物瘦肉率的药物。由于长期使用β-兴奋剂会对人和动物的肝脏、肾脏等内脏器官产生严重的毒副作用。大部分欧美国家禁用β-兴奋剂类药物，我国农业部公告第235号(2002)规定严禁在畜牧生产中使用各类β-兴奋剂类药物。 图1莱克多巴胺结构式 本文参考《GB/T 22147-2008 饲料中沙丁胺醇、莱克多巴胺和盐酸克伦特罗的测定液相色谱质谱联用 法》[]，建立了利用全自动固相萃取仪(EXTRA)结合液相色谱-串联质谱联用(High PerformanceLiquid Chromatography Triple Quad MassSpectrometry， LC-MS/MS)检测饲料中莱克多巴胺的方法。在(1+9)0.1 mol/L盐酸-甲醇提取后，选用 EXTRA 全自动固相萃取仪，自动完成 SPE 柱活化、样品上样、淋洗、收集等步骤，收集液再氮吹浓缩、溶剂转换、定容后，用LC-MS/MS 检测。 图1 EXTRA 全自动固相萃取仪 2试剂、仪器及器材 2.1试剂 甲醇：色谱纯级；浓盐酸、冰乙酸、25%氨水：优级纯； 提取液：(1+9)0.1 mol/L盐酸-甲醇，移取 10mL0.1mol/L 盐酸于90 mL甲醇中，混匀； 2%冰乙酸：0.2mL冰乙酸用水稀释至10 mL； 淋洗先：移取0.9mL 浓盐酸于 100 mL水中，混匀； 洗脱液：移取10 mL 25%氨水于 100 mL容量瓶中，用甲醇定容； 定容液：含0.1%甲酸的(2+8)甲醇-水溶液； 100 p g/mL 莱克多巴胺标准储备液：准确称取标准品1mg， 于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为100 p g/mL的标准储备液，-20℃以下保存；配制 1 u g/mL 莱克多巴胺标准使用液； 标准工作曲线：用1p g/mL 多氯联苯标准使用液配制标准系列，浓度为0.01 pg/mL、0.05p g/mL、0.10 p g/mL、0.50p g/mL、1 1p g/mL。 实验用水均为超纯水(电导率=18.2MQ·cm)，取自 Milli-Q制水机(Millipore， USA)。 2.2仪器及器材 固相萃取柱： MCX， 60 mg/3mL，上海安谱； 全自动固相萃取仪： EXTRA，上海屹尧仪器科技发展有限公司； 液相色谱-串联质谱联用仪： Agilent 1290 infinity - 6490 Triple Quad MS； 分析天平；旋涡混合仪；超声波清洗仪；离心机；氮 吹仪；移液枪；离心管；容量瓶；玻璃滴管；收集管； 样品管；0.22pm针头式滤膜。实验中所用玻璃器皿 使用前均经450℃高温灼烧4h后冷却备用。 3实验方法 3.1前处理方法 3.1.1提取 称取饲料样品5.00g(精确至0.01g)样品，置于80 mL离心管中，加入20 mL提取液，振荡混匀，超声辅助萃取 15 min， 4000 r/min 离心 10 min， 取上清液于50mL容量瓶，残渣加入20 mL、10mL提取液，重复萃取2次，合并萃取液于容量瓶中，用提取液定容至50 mL。取5 mL 萃取液于进样管中，氮气吹至近干，加入2mL 2%冰乙酸，涡旋振荡，待进样。 3.1.2净化 MCX 柱预先用5 mL甲醇、5 mL水活化后，保持柱体湿润，上样时速度不超过1 mL/min， 待液体低于柱体，分别用5mL淋洗液、5mL甲醇淋洗小柱，后用8 mL洗脱液洗脱。具体程序见表1。 动作 位置 溶剂 体积 抽溶剂速度 打溶剂速度 (mL) (mL/min) (mL/min) 外壁 水 6 90 90 活化1 甲醇 5 20 1 活化2 水 5 20 1 空气 1 6 6 上样 2.2 20 0.8 空气 1 6 6 外壁 水 6 90 90 淋洗1 淋洗液 5 20 空气 1 6 6 淋洗2 甲醇 5 20 1 空气 1 6 6 洗脱液 10 20 1 空气 3 6 6 3.1.3定容 将收集到的液体在40℃水浴中氮吹蒸发至近干，用定容液定容至1.0mL， 过0.22 u m 滤膜待进样。 3.2检测方法 3.2.1色谱条件 色谱柱为 Pheriomenex Kinetex C18柱，长度100mm， 内径3.0mm，涂层粒径2.6 um； 柱温30℃，流速：0.30 mL/min，进样量：10.0 pL。流动相为超纯水(A)和含0.1%甲酸的乙腈溶液(B)；梯度洗脱程序如下：初始10%B，保持1min， 1-6 min40%B， 6.01 min 60%B，保持2 min， 8.01 min 10%B，保持2 min， 共 10 min。 3.2.2质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描，多反应选择监测(Multiple Reaction Monitoring， MRM)模式；鞘气温度(Sheath Gas Temperature) 350°C，鞘气流速( Sheath Gas Flow )11 L/min，氮气发生器提供；干燥气温度( Dry Gas Temperature) 160°C，干燥气流速( Gas Flow) 16 L/min，氮气发生器提供；雾化气压力( Nebulizer Pressure ) 30 psi； 喷嘴电压(Nozzle Voltage) 1500V；碰撞气( CollisionGas)为高纯氮气，气体纯度≥99.999%。质谱MRM 采集参数、目标物标准品的 MRM 谱图见图2。 图2目标物标准品的 MRM 谱图 4结果与讨论 4.1：基底加标回收率及精密度 在(5.00±0.01)g空白样品中添加一定量的标准混合溶液，使样品中目标物的量达到40 ng/g，考察方法的回收率和重现性。采用外标法对样品进行计算，加标回收率、相对标准偏差如表2所示。 表3样品加标回收率及相对标准偏差 Response Detected Recovery RSD (ng/g) 空白 1508 0.0 / 加标1 5382102 35.1 87.7% 1.01% 加标2 5290039 34.3 85.8% 1.01% 4.27样品检测结果 按照本文所述方法对实际样品进行分析，空白基底干净(见图3)，加标样品(见图4)回收率在85.8%-87.7%之间，相对标准偏差为1.01%，目标物回收率良好，重复性好，满足检测需求。 图3空白样品谱图 图4加标样品谱图 5结论 本方法采用甲醇对饲料中的莱克多巴胺进行提取，全自动固相萃取进行样品净化，有效地去除了样品中的干扰成分，然后利用液相色谱-串联质谱联用进行检测。检测结果表明，该方法回收率符合要求，重现性高。 上海屹尧仪器科技发展有限公司 ( 服务热线：4 0 0-820-44 6 9 ) (021-5442 7 296 54426316 )