鼠伤寒沙门菌中代谢物检测方案(气质联用仪)

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SSL-CA14-770Excellence in Science Excellence in ScienceGCMSMS-146 http：//www.shimadzu.com.cn上海市徐汇区宜州路180号华鑫天地二期C801栋咨询电话：021-34193996Hotline： 021-34193996Building C801， No.180 Yizhou Road， Shanghai GCMS-TQ8050结合代谢物数据库分析鼠伤寒沙门菌代谢物 GCMSMS-146 摘要：本文使用岛津公司三重四极杆气相色谱质谱联用仪 GCMS-TQ8050 结合代谢物数据居，在无标准品情况下， 建立了467种代谢物的 MRM 筛查方法，利用此筛查方法对鼠伤寒沙门菌 slyA 基因缺失株胞内及胞外样本中代谢物进行筛查定性，分别筛查出胞内代谢物77种，胞外代谢物31种，并以2-异丙基苹果酸为内标对筛查出的代谢物进行了半定量。 关键词：三重四极杆气相色谱质谱联用仪代谢物鼠伤寒沙门菌 SlyA蛋白， 由 slyA 基因编码，是鼠伤寒沙门菌的一种双分子螺旋、翼状转录调控子。最初， slyA 被认为是编码大肠杆菌溶血素的基因，近年来的研究发现，slyA 不仅编码溶血素，还参与鼠伤寒沙门菌毒力的调控。 目前对鼠伤寒沙门菌 SlyA 蛋白的研究仅仅局限于转录水平，进一步阐明SlyA 蛋白对代谢谱的影响将有助于揭示鼠伤寒沙门菌的毒力调控机制，推动新型药物及疫苗的研发。 实验部分 1.1仪器 GCMS-TQ8050三重四极杆气质联用仪 1.2分析条件 色谱柱： DB-5(30m×0.25 mm×1.0 um) 柱温程序：100℃(4 min)_4℃/min_320℃(8min) 进样口温度：280℃ 载气控制方式：恒线速度 线速度：39 cm/sec 岛津公司专门为代谢物分析开发了代谢物数据库，该数据库库盖了568种 (Scan)、475种(MRM)代谢物(氨基酸、有机酸、脂肪酸等)的质谱图、保留指数、MRM 离子对等信息，可实现在无标准品的情况下快速筛查样品中代谢物。本文使用 GCMS-TQ8050结合岛津代谢物数据库，建立了467种代谢物 MRM 筛查方法。使用 MRM方法对鼠伤寒沙门菌 slyA 基因敲除菌株的胞内及胞外样本中的代谢物进行了筛查定性。 进样方式：分流进样 分流比：10：1 离子源温度：200℃ 接口温度：280C 检测器电压：调谐电压 +0.5 kV 采集模式：MRM 1.3样品前处理 1.3.1胞代代谢物提取 菌株淬灭处理：吸取5mL对数生长期的菌液加入到事先准备好的25 mL 60%，-40℃的冷甲醇/水溶容中。随后于-10℃，12000 r/min， 离心5 min， 弃去上清液。收集菌体并向其中加入5pL2-异丙基苹果酸吡啶溶液(0.5ug/uL)作为内标物。 代谢物提取：移取2mL乙醇至菌体沉淀中，涡旋混匀后于90℃孵育 10 min， 孵育过程中震荡混匀两次。将样品置于-40℃超低温冰箱中冷却5 min。取出冷却后的样品，震荡混匀，吸取1mL置于2mL的EP管中，于-10℃，14800 r/min， 离心10 min。移取 450 uL 上清液于1mL EP 管并置于离心干燥仪中，45℃离心干燥9 h。干燥后的样品于-80℃冰箱保存。 1.3.2胞外代谢物提取 吸取5mL对数生长期的菌液快速通过0.22 um 的除菌滤膜 (30 sec 内完成)。移取100 uL 滤液于1mLEP管中， 10 uL2-异丙基苹果酸吡啶溶液(0.5pg/uL) 作为内标物。，在离心缩缩仪中蒸干后于-80℃冰箱保存。 1.3.3衍生化 将待检样品从-80℃冰箱取出，再次干燥离心半小时后，向样品中加入80 uL甲基化试剂， 30℃， 1200 r/min，孵育 90 min。随后向样品中加入40 uL硅烷化试剂，37℃， 1200 r/min， 孵育 30 min。衍生后的样品于12000r/min 高速离心机中离心5 min。吸取60 uL上清液于进样瓶中供 GC-MS/MS分析。 结果与讨论 2.1鼠伤寒沙门菌代谢物 MRM 方法建立过程 使用代谢物数据库方法包中的OA_TMS_DB5_67 min_V3_HC 方法测定正烷烃(C9-C33)标液，用于调整数据库中代谢物的保留时间。正构烷烃质量量谱图见图1。 图1正构烷烃(C9-C33)质量色谱图(5ug/mL) 然后利用正构烷烃数据及 Smart Metabolites Database 建立467种代谢物 MRM方法文件。图2为 SmartMetabolites Database 数据库的创建方法界面。 图2 Smart Metabolites Database创建MRM方法界面 2.2鼠伤寒沙门菌胞内代谢物 TIC图与定性结果 通过 GCMS-TQ8050 调用建立的467种代谢物衍生产物 MRM 方法，并对按着1.3过程处理后的鼠伤寒沙门菌胞内样品进行筛查分析，胞内代谢物衍生产物 TIC图如图3所示。 图3鼠伤寒沙门菌胞内代谢物TIC图 表1鼠伤寒沙门菌胞内代谢物定性结果 No. 中文名称 英文名称 保留时间(min) CAS号 代谢物与内标 峰面积比值 1 丙酮酸-meto-TMS Pyruvic acid-meto-TMS 9.194 127-17-3 0.0034 2 乳酸-2TMS Lactic acid-2TMS 9.618 79-33-4 0.69 3 2-羟基异丁酸-2TMS 2-Hydroxyisobutyric acid-2TMS 9.816 594-61-6 0.0034 4 己酸-TMS Caproic acid-TMS 9.931 142-62-1 0.15 5 乙醇酸-2TMS Glycolic acid-2TMS 10.046 79-14-1 0.051 6 丙氨酸-2TMS Alanine-2TMS 11.038 302-72-7 0.19 7 甘氨酸-2TMS Glycine-2TMS 11.540 56-40-6 0.0084 8 羟胺-3TMS Hydroxylamine-3TMS 11.716 7803-49-8 0.073 9 草酸-2TMS Oxalic acid-2TMS 11.841 144-62-7 0.00062 10 3-羟基丙酸-2TMS 3-Hydroxypropionic acid-2TMS 12.370 503-66-2 0.051 11 2-氨基异丁酸-2TMS 2-Aminoisobutyric acid-2TMS 12.471 62-57-7 0.017 12 3-羟基丁酸-2TMS 3-Hydroxybutyric acid-2TMS 12.970 300-85-6 0.0076 13 3-氨基丙酸-2TMS 3-Aminopropanoic acid-2TMS 14.040 107-95-9 0.0098 14 3-羟基异戊酸-2TMS 3-Hydroxyisovaleric acid-2TMS 14.756 10237-77-1 0.034 15 结氨酸-2TMS Valine-2TMS 15.071 72-18-4 0.65 16 苯甲酸(安息香酸) -TMS Benzoic acid-TMS 16.114 65-85-0 0.54 17 二羟基丙酮-meto-2TMS Dihydroxyacetone-meto-2TMS 16.258 96-26-4 0.015 18 辛酸-TMS Octanoic acid-TMS 16.505 124-07-2 0.078 19 2-氨基乙醇-3TMS 2-Aminoethanol-3TMS 16.924 141-43-5 0.090 54 腐胺(丁二胺)-4TMS Putrescine-4TMS 31.935 110-60-1 0.50 55 甘油-3-磷酸-4TMS Glycerol 3-phosphate-4TMS 32.537 57-03-4 1.6 56 O-磷酸乙醇胺-4TMS O-Phosphoethanolamine-4TMS 33.166 1071-23-4 0.13 57 2-氨基庚二酸-3TMS 2-Aminopimelic acid-3TMS 33.635 627-76-9 0.017 58 鸟氨酸-4TMS Ornithine-4TMS 34.050 70-26-8 0.012 59 柠檬酸-4TMS Citric acid-4TMS 34.116 77-92-9 0.0015 60 十四烷酸-TMS Myristic acid-TMS 34.397 544-63-8 0.33 61 腺嘌呤-2TMS Adenine-2TMS 35.317 73-24-5 0.098 62 葡萄糖-meto-5TMS(1) Glucose-meto-5TMS(1) 36.508 50-99-7 0.024 63 赖氨酸-4TMS Lysine-4TMS 36.688 56-87-1 0.074 64 酪氨酸-3TMS Tyrosine-3TMS 37.149 60-18-4 0.0093 65 1-十六醇-TMS 1-Hexadecanol-TMS 37.242 36653-82-4 0.030 66 半乳糖醛酸-meto-5TMS(2) Galacturonic acid-meto-5TMS(2) 38.432 14982-50-4 0.0027 67 棕榈油酸-TMS Palmitoleic acid-TMS 38.904 373-49-9 0.043 68 葡萄糖酸-6TMS Gluconic acid-6TMS 39.227 526-95-4 0.0019 69 棕榈酸(十六烷酸)-TMS Palmitic acid-TMS 39.346 57-10-3 7.6 70 5-磷酸核糖-meto-5TMS(1) Ribose 5-phosphate-meto-5TMS(1) 41.663 3615-55-2 0.0088 71 十七酸-TMS Margaric acid-TMS 41.660 506-12-7 0.24 72 十八醇-TMS Octadecanol-TMS 41.929 112-92-5 0.20 73 降肾上腺素-5TMS Norepinephrine-5TMS 42.628 51-41-2 0.0095 74 反油酸-TMS Elaidic acid-TMS 43.512 112-79-8 0.045 75 硬脂酸-TMS Stearic acid-TMS 43.900 57-11-4 6.5 76 腺苷-4TMS Adenosine-4TMS 52.469 58-61-7 0.053 77 蔗糖-8TMS Sucrose-8TMS 53.090 57-50-1 0.024 78 鸟苷-5TMS Guanosine-5TMS 55.022 118-00-3 0.0013 图4鼠伤寒沙门菌胞内部分代谢物及内标物衍生产物MRM图 2.3鼠伤寒沙门菌胞外代谢物定性结果 使用467种代谢物衍生产物 MRM 方法，对鼠伤寒沙门菌胞外代谢物进行筛查分析，胞外代谢物衍生产物 TIC图如图5所示。 (x10，000) 图5鼠伤寒沙门菌胞外代谢物TIC图 表2鼠伤寒沙门菌胞外代谢物定性结果 2-异丙基苹果酸-3TMS(内标) 苯基丙氨酸-2TMS 赖氨酸-4TMS 图6鼠伤寒沙门菌胞外部分代谢物及内标物衍生产物MRM图 结论 本文利用 GCMS-TQ8050 结合岛津代谢物数据库自动创建467种代谢物的 MRM 分析方法。通过建立的 MRM 方法对鼠伤寒沙门菌 slyA 基因敲除株胞内和胞外代谢物进行筛查，并以2-异丙基苹果酸作为内标，对筛查出的代谢物进行了半定量。在无测定目标组分标准品的情况下，鉴定出胞内代谢物77种，胞外代谢物31种。实验结果显示，岛津 Smart Metabolites Database 为细菌代谢组学的研究提供了一种快捷、可靠的分析途径。 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Center 使用岛津公司三重四极杆气相色谱质谱联用仪GCMS-TQ8050结合代谢物数据库，在无标准品情况下，建立了467种代谢物的MRM筛查方法，利用此筛查方法对鼠伤寒沙门菌标准株ATCC 14028胞内及胞外样本中代谢物进行筛查定性，分别筛查出胞内代谢物77种，胞外代谢物31种，并以2-异丙基苹果酸为内标对筛查出的代谢物进行了半定量。