中草药和营养保健品中非法添加的合成掺杂物检测方案(液相色谱仪)

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「应用纪要1THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. [应用纪要] Waters Dhavalkumar Narendrabhai Patell， Lirui Qiao?， Jimmy Yuk3， Kate Yu}1沃特世亚太公司(新加坡)；?沃特世公司(中国上海)；3沃特世公司(美国马萨诸塞州米尔福德) 应用优势 基于UNIFI@的天然产物应用解决方案中的掺杂物非法添加筛查解决方案包括一系列工作流程 基于UNIFI的天然产物应用解决方案采用了超高效液相色谱(UPLC)，串联四极杆飞行时间质谱仪(Q-TofIM MS)进.行数据采集，为用户提供了从样品到报告的一站式解决方案 该方案操作简单，能够显著提升非法添加物筛查与鉴定的效率，而且对操作者的专业背景要求很低 沃特世解决方案ACQUITY UPLCI-Class系统XevoG2-XSQTof质谱仪基于UNIFI的天然产物应用解决方案 关键词 合成掺杂物鉴定，掺假，UNIFI合成掺杂物数据库， UPLC/Q-Tof MS，非数据依赖型采集，中草药保健品 营养保健品， LC/MS工作流程 简介 近年来，将天然产物应用于中草药保健品以达到保健和治疗目的的应用呈现出不断增长的态势。遗憾的是，这种趋势也为不法制造商向产品中掺杂化学药提供了可趁之机。中草药产品掺假相关的严重案例甚至致死案例时有发生'。由于这种掺假行为对消费者构成了巨大威胁，天然产物领域引起了全球范围以及各监管机构的极大关注。 液质联用(LC-MS)被广泛应用于中草药保健品的筛查分析，因为该技术的高灵敏度和良好选择性对于分析具有典型复杂基质的天然产物样品来说至关重要。然而， LC-MS面临的一个主要挑战是缺少稳定的精简工作流程，从而快速、轻松地实现从样品到报告的整个过程。 在本应用纪要中，我们将以市售中草药保健品的分析为例，向您展示基于UNIFI的天然产物应用解决方案中的掺杂物筛查应用以及掺杂化学药数据库的实用性。本实验所用的产品为市售的中草药胶囊，其主要功效是缓解背部和关节疼痛(由类风湿性关节炎引发)。产品标签中宣称该产品含有胡黄连和马钱子等多种中草药。基于UNIFI的天然产物应用解决方案中的掺杂物筛查应用能够自动检测非法添加的化学药，然后通过简单的审查过程确证识别出掺杂物，从而快速得出结论。 我们所展示的一站式解决方案采用了从样品到报告的精简工作流程，该工作流程通过基于UNIFI的天然产物应用解决方案中的掺杂物筛查应用实现。图1展示了整个分析过程，该流程将所有步骤(数据采集、峰选择、数据库搜索、碎片离子确证和报告生成)整合于一个精简的工作流程中。此外，利用结构解析工具还能对没有与数据库匹配结果的未知峰作进一步研究。 样品制备 将1g粉末状样品(图2)加入10 mLLC-MS级甲醇中，超声处 理20min， 然后离心5 min (RCF 4472 g)。进样前用甲醇将 上清液稀释250倍(进样量1pL)。 使用儿茶素混合标准品(部件号186007465)进行系统适应 性测试。用甲醇将储备液稀释10倍，使其最终浓度为 10 ug/mL。进样量为1pL。 LC条件LC系统： 配备Flow Through Needle(FTN)样品管理器的ACQUITY UPLCI-Class系统色谱柱： ACQUITY UPLC HSST3，1.8pm， 2.1x100 mm， 40℃样品温度： 15℃流动相A： 水+0.1%甲酸 流动相B： 0.1%甲酸的乙腈溶液 梯度表： 流速 溶剂A 溶剂B 时间 (mL/min) (%) 曲线 0 0.6 2 初始 0.5 0.6 6 1.0 0.6 5 6 5.0 0.6 6 9.0 0.6 6 11.0 0.6 6 12.0 0.6 6 12.5 0.6 6 14.5 0.6 0 100 1 15 0.6 2 17 0.6 2 MS条件 MS系统： Xevo G2-XS QTof 采集范围： 50-1500Da 扫描时间： 0.1 s 采集模式： ESI+和ESI-； MS；分辨率模式 锁定质量数参比化合物：亮氨酸脑啡肽(LE) 0.2 ppm(扫描0.3s，间隔：：330s) 毛细管电压： 1.5KV(ESI+) 1.5KV(ESI-) 锥孔电压： 40V 碰撞能量(eV)： 低CE：E：6 高CE： 10-40 离子源温度： 120℃ 脱溶剂气温度： 500℃ 锥孔气流速： 50L/h 脱溶剂气流速： 1000L/h 采集时间： 17 min 数据管理 使用基于UNIFI的天然产物应用解决方案进行仪器控制、数据挖掘和报告生成。 基于UNIFI的天然产物应用解决方案能够为两种类型的应用提供一站式解决方案：：天然产物的成分分析以及中草药保健品的掺杂物筛查。每种应用都有一套相应的工作流程。在成分分析应用中，集成了中药数据库的工作流程将提供一套总共14种的预置模板(可链接至特定视图的数据过滤器)。有关使用成分分析应用的详细信息，请参见先前的应用纪要2.4。 掺杂物筛查应用将利用一套采用通用条件和参数的专用数据采集方法进行数据采集。方案还额外提供包含一套共7种模板的专用工作流程，其中集成了用于掺杂物筛查、审查和确证的掺杂化学药的数据库。最后，该方案还提供可自动生成报告的特定报告模板。与成分分析应用类似，掺杂物筛查应用也需要使用儿茶素混合标准品和绿茶提取物进行系统适应性测试，和UNIFI的天然产物应用解决方案相一致。 使用LC-MS对中草药保健品中的掺杂化学药进行筛查和鉴定时，研究人员面临的最大挑战之一就是在目标数据库中搜索不到匹配结果。为了解决这一难题并加快整个分析进程，我们创建了掺杂化学药数据库，并将其作为关键组件整合到掺杂物筛查应用中。 图1.基于UNIFI的天然产物应用解决方案中的掺杂物筛查应用的分步流程图。 图2.市售粉末状抗炎中草药保健品。 图3所示为掺杂化学药数据库的详细截屏。库中包含中草药保健品中常见的一系列合成掺杂化合物。这些化合物以英文和简体中文列出，并按已知的药理作用进行了分类。库中还提供每种化合物的其它相关信息，例如化学结构、分子式、平均分子量和单同位素精确分子量、CAS号、Chemspider ID和PubChem ID。此外，每个化合物条目还包括关键诊断碎片离子的信息。 图3.合成掺杂物数据库的基本布局截屏。A)化合物条目的示例截屏。B)项目标签中的药理作用列表。 UPLC/Q-Tof MS实验采用MS数据采集模式进行样品分析，其本质上属于非数据依赖型采集策略。质谱仪采用两种独立的采集模式单次LC进样的数据，其中一种利用低碰撞能量采集集扫描MS母离子信息，另一种则利用高碰撞能量采集相应的MS/MS碎片离子信息。系统根据LC保留时间对齐方式并关联两组数据，得到包括样品中每种分析物MS和MS/MS信息的检测结果。图4所示为测试样品单次进样所得的两种UPLC/Q-Tof MS基峰离子(BPI)色谱图。图4A是低CE扫描的BPI，图4B是高CE扫描的BPI。 图4.抗炎胶囊样品的UPLC/Q-Tof MS BPI色谱图。4A)低CE扫描的BPI；4B)高CE扫描的BPI。 数据处理将自动进行，并且仅需极少的参数设置，这得益于基于UNIFI的天然产物应用解决方案中的掺杂物筛查应用所提供的模板。唯一需要做的是调用特定的样品处理方法，该操作可确保所选的分析方法正确无误及各种参数与特定的分析相匹配，同时确保分析方法已成功导入掺杂物数据库。接下来用户需打开数据查看界面，单击“处理”选卡卡，然后等待结果显示，所有处理步骤都将自动进行。 单击“处理”按钮之后，系统进行的处理步骤包括：1.根据“3D峰检测”结果进行峰选择，获取完整的样品峰列表。低CEMS全扫描和高CEMS全扫描模式下的峰选择将同时进行。2.将低CE MS全扫描得到的组分列表与数据库中的母离子信息进行匹配。3.通过匹配数据库中的已知关键诊断碎片离子或匹配MassFragmentM在高CE MS全扫描中生成的预测碎片离子来确证碎片离子。MassFragment是一款模拟信息学工具，该软件利用给定化合物的mol文件结构，根据分子中的键能大小预测可能的碎裂方式。这对于正确匹配化合物以及排除假阳性结果非常有帮助。 图5所示为处理完成时所显示的结果查看窗口的截屏。UNIFI科学信息系统中的查看窗口都是一致的。分析结果在该窗口的多个区域中分组显示，并在下方进行详细说明。 图5A所示为掺杂物筛查应用中的可用预置模板。如前所述，基于UNIFI的天然产物应用解决方案可提供两套完整的工作流程：成分分析应用2-4和掺杂物筛查应用。 解决方案为掺杂物筛查应用提供了一套总共7种的工作流程模板，以便于用户轻松查看结果和进行确证。。“系统适应性”模板将在分析之前进行常规系统检查，以确保数据质量。“良好匹配”模板将列出匹配掺杂物化学药数据库的所有化合物(离子计数高于5，000)。所列出的结果必须有匹配的母离子(质量数误差<2mDa)以及至少一种诊断碎片离子。“疑似匹配”模板将列出仅母离子匹配合成掺杂物数据库的所有化合物(离子计数高于5，000)。“无匹配的高强度结果”模板将列出在掺杂物化学药数据库中没有匹配结果的所有化合物(离子计数高于20，000)。“全部鉴定结果”模板将列出匹配合成掺杂物数据库的所有化合物(离子计数高于5，000)。“已确证表格”模板和“已确证图谱”模板则能够快速查看用户已审查和确证的全部化合物。 图5.处理完成后， UNIFI科学信息系统的“查看”选项卡中所显示的结果。5A)可用工作流程列表。掺杂物筛查应用共提供7种预置模板。此处的ADL指掺杂物。5B)“良好匹配”过滤器得出的相关组分列表。5C)掺杂物在m/z309.1599处的XIC。 5D)XIC对应的MS谱图，包括低碰撞能MS全扫描谱图和高碰撞能MS扫描谱图。 图5B为各指定预置工作流程模板所对应的组分列表。该区域列出了检出化合物的全部关键信息，例如预期中性质量数(Da)、实际观察到的中性质量数(Da)、质量数误差(ppm)、观察到的保留时间(min)、响应因子以及加合物离子。在该应用示例所分析的中草药保健品中，“良好匹配”结果仅包含保泰松公种组分。保泰松是一种非甾体抗炎药(NSAID)，由于其具有抑制白细胞生成和导致再生障碍性贫血等严重不良影响，美国和英国已禁止将其用于人类5。 图5C展示了图5B中所示组分分应的提取离子色谱图(XIC)。在该示例中，由于选择了图5B的“良好匹配”模板中的保泰松组分，因此图5C显示的是该组分对应的XIC。 图5D为图5B中所列组分及图5C中所示的XIC对应的MS谱图。其中，上方谱图为MS全扫描谱图，下方谱图为MS谱图，者均对应m/z 309.1599处的XIC中的9.27 min峰。在MS谱图中，蓝色标记表示与掺杂化学药数据库的预期碎片离子列表匹配的碎片离子。 为便于查看，用户还可以选择将所有匹配的碎片离子以表格形式列于高能量谱图下方，如图5D所示。对于保泰松，高能量谱图中可观察到其所有预期碎片离子。 随着中草药保健品掺假的势头愈演愈烈，新的合成掺杂物以及常见掺杂化学药的类似物不断出现，照此发展，无论数据库内容多么丰富，都始终存在不匹配的化合物。任何高丰度的未匹配峰都需要作进一步研究。此类峰将列于“无匹配的高强度结果”下(图6A和图6B)。要进一步研究无匹配结果的高强度组分，可使用结构解析工具6。右键单击并从下拉列表中选择“解析”，即可轻松访问结构解析工具(图6E)。在该具体样品的分析结果中，“无匹配的高强度结果”下列出了一种保留时间为8.29 min的高强度组分(图6C)。 图7按顺序展示了解析的关键步骤。步骤1为根据精确质量数确定组分的元素组成。UNIFI科学信息系统的元素组成确定功能的独特之处在于，其参数设置中除了包括母离子精确质量数和同位素分布之外，还将MS/MS碎片离子的同位素信息考虑在内(如图7步骤1所示)。 图6.“无匹配的高强度结果”预置模板(图6A)得到的在合成掺杂物数据库中无匹配结果的高强度组分(图6C中的红框)。选择“解析”选项可使用结构解析工具(图6E)。6B)各工作流程的相关组分列表。6D)图6B中选定组分的高能量和低能量扫描谱图。 该功能显著减少了假阳性结果的数量。另外，软件还将生成i-FITIM可信度(%)，以表明分子式的可信度。数值越高表明可信度越高。在该样品的分析结果中，元素组成匹配结果C.。H.N.O的i-FIT得分最高，达99.86%。 步骤2是已经嵌合在UNIFI软件中的公共在线数据库ChemSpider(拥有来自500余个数据库的化合物条目信息)中进行数据库搜索。UNIFI科学信息系统允许用户选择检索参数，并可直接链接至ChemSpider。在此次分析中， ChemSpider检索给出了一个初始匹配结果，羟基保泰松，该物质是保泰松的代谢物，同样同于NSAID。 步骤3是通过碎片离子的结构解析来验证和确认初始匹配结果。该步骤利用MS扫描提供的二级碎片离子，并采用MassFragment软件进行确证。MassFragment是一种结构解析工具，可根据任意mol文件结构进行模拟计算，并根据分子中的键能大小预测可能的碎裂模型。随后软件会将预测的碎片离子与MS扫描得到的碎片离子进行比对。这对于正确匹配结果的确证和假阳性结果的排除非常有帮助。如图7中的步骤3所示，软件检查了MassFragment预测的羟基保泰松的可能碎片离子，并将其与同一样品经高碰撞能量扫描得到的碎片离子进行匹配。结果表明，高CEMS谱图中存在预测的羟基保泰松碎片离子，该结果确证了软件识别的未知峰为羟基保泰松。 因此，此次分析从中草药保健品样品中检出并鉴定出了两种合成掺杂物，保泰松和羟基保泰松。它们同属于非甾体抗炎药。随后软件将使用报告模板自动生成最终的分析报告，如图8所示。 图7.利用结构解析工具鉴定和确证8.29 min处的未知洗脱组分的分步流程。 图8.成分鉴定结果汇总报告，该报告可通过导入天然产物掺假汇总报告模板轻松获取。 本应用纪要以市市中草药保健品的分析为例，展示了基于UNIFI的天然产物应用解决方案中的掺杂物筛查应用的实用性。该方案通过单次LC进样鉴定并确证了两种中成掺杂物：保泰松和羟基保泰松(均为非甾体抗炎药)，并且在几小时内即可完成从样品到报告的整个过程。 基于UNIFI的天然产物应用解决方案中的掺杂物筛查应用包含一套采集方法模板、处理方法模板、合成掺杂物数据库、一套专用的工作流程以及一个报告模板，能够为用户提供从样品到报告的精简工作流程。采用该方案，用户能够快速获得可靠的市售产品检测结果，无需具备化学研究的相关专业知识或大量的相关经验，，因此，该方案能够显著提升合同检测实验室和监管机构的效率和生产率。 ( 参考文献 ) ( 1 . 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