细菌细胞外荚膜中染色法检测方案(抗体 试剂盒)

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一、实验目的和要求 (1)学习并掌握荚膜染色法。 (2)学习芰膜染色法的原理。 二、基本原理 荚膜是包围在细菌细胞外的一层黏液状或胶状物质，其成分为多糖、糖朊或多肽。由于荚摸与染料的亲和力弱、不易着色，而且可溶于水，易在用水冲洗时被除去，所以通常用衬托染色法染色，使菌体和背景着色，而荚膜不着色，在菌体 (​http:​/​​/​www.biaowu.com​/​HTML_Products​/​51​/​products_43651.html" \o "炭疽杆菌噬菌体​)周围形成一透明圈。荚膜含水量高，制片时通常不用热固定，以免变形影响观察。下面介绍四种荚膜染色法，其中湿墨水法较简便，并适用于各种有荚膜的细菌。 三、实验材料与设备 1．菌种 褐球固氮菌或胶质芽孢杆菌约2d无氮培养基琼脂斜面培养物。 2．染色剂 1％甲基紫水溶液、1％结晶紫水溶液、6％葡萄糖水溶液、20％硫酸铜水溶液、甲醇 (​http:​/​​/​www.biaowu.com​/​HTML_Products​/​66​/​products_2766.html" \o "甲醇中7种苯系物混合（标样）​)、黑色素。 黑色素是一个通用名，代表一大类在大多数有机体中存在的天然色素，一般认为是酪氨酸在黑色素细胞中经过一系列氧化和聚合生成的。黑色素的配制方法为：将黑色素(5g)在蒸馏水(100mL)中煮沸5min，然后加入40％甲醛0．5mL，作防腐剂。试剂应至少满足但不限于如下标准：GB／T 683—2006《化学试剂 甲醇》、HG／T 4581—2013《化学试剂高效液相色谱淋洗液甲醇》。 3．仪器或其他用具 载玻片、盖玻片、滤纸、显微镜等。 四、操作步骤 1．湿墨水法 1)制备茵和黑色素混合液 加一滴黑色素于洁净的载玻片上，然后挑取少量菌体与其混合均匀。也有用墨水和黑色素替换的。墨水和黑色素都属于混合物，可以溶液替换。 2)加盖玻片 将一洁净盖玻片盖在混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，轻轻按压以吸去多余的混合液。加盖玻片时勿留气泡，以免影响观察。 3)镜检 用低倍镜和高倍镜观察，用相差显微镜观察效果更好。背景灰色，菌体较暗，菌体周围明亮的透明圈即为荚膜。 2．干墨水法 1)制混合液 加一滴6％葡萄糖液水溶液于洁净载玻片的一端，然后挑取少量菌体与其混合，再加一杯黑色素，充分混匀。玻片必须洁净无油迹，否则，涂片时混合液不能均匀散开。 2)制推片 另取一段边缘光滑的载玻片作推片，将推片一端的边缘置于混合液前方，然后稍向后拉。当推片与混合液接触后，轻轻左右移动，使之沿推片接触的后缘散开，之后以大约30。角迅速将混合液推向另一端，使混合液铺成薄层(图2—14)。 3)干燥 空气中自然干燥。 4)固定 用甲醇浸没涂片固定。 5)干燥 在酒精灯上方用文火干燥。 6)染色 用甲基紫染1～2min。 7)水洗 用自来水轻轻冲洗，自然干燥。 8)镜检 用低倍和高倍镜观察。背景灰色，菌体紫色，菌体周围的清晰透明圈为荚膜。 3.安东尼(Anthony)氏法 1)涂片 按常规取菌涂片。 2)固定 空气中自然干燥。不可加热干燥固定。 3)染色 用1％的结晶紫水溶液染色2min。 4)脱色 以20％的硫酸铜水溶液冲洗，用吸水纸吸干残液。 5)镜检 干后用油镜观察。菌体染成深紫色，菌体周围的荚膜呈淡紫色。 4．奥尔特氏法 1)涂片 按常规取菌涂片。 2)固定 空气中自然干燥，或在火焰上加热固定。 3)染色 将沙黄3g与蒸馏水100mL混合，并用乳钵研磨溶解配成沙黄染色液。滴加染色液至涂片，并加热至产生蒸汽后，继续染色3min。水洗，待干。 4)镜检 干后用油镜观察。炭疽芽孢杆菌菌体呈赤褐色，荚膜呈黄色。 五、实验报告 1．实验结果 绘图说明四种染色方法所观察到的细菌的菌体和荚膜的形态。有条件的拍照比对说明。 2．思考题 (1)试比较四种荚膜染色法的优缺点。 (2)通过荚膜染色法染色后，为什么被包在荚膜里的菌体着色而荚膜不着色? 一、实验目的和要求(1)学习并掌握荚膜染色法。(2)学习芰膜染色法的原理。二、基本原理荚膜是包围在细菌细胞外的一层黏液状或胶状物质，其成分为多糖、糖朊或多肽。由于荚摸与染料的亲和力弱、不易着色，而且可溶于水，易在用水冲洗时被除去，所以通常用衬托染色法染色，使菌体和背景着色，而荚膜不着色，在菌体周围形成一透明圈。荚膜含水量高，制片时通常不用热固定，以免变形影响观察。下面介绍四种荚膜染色法，其中湿墨水法较简便，并适用于各种有荚膜的细菌。三、实验材料与设备1．菌种褐球固氮菌或胶质芽孢杆菌约2d无氮培养基琼脂斜面培养物。2．染色剂1％甲基紫水溶液、1％结晶紫水溶液、6％葡萄糖水溶液、20％硫酸铜水溶液、甲醇、黑色素。黑色素是一个通用名，代表一大类在大多数有机体中存在的天然色素，一般认为是酪氨酸在黑色素细胞中经过一系列氧化和聚合生成的。黑色素的配制方法为：将黑色素(5g)在蒸馏水(100mL)中煮沸5min，然后加入40％甲醛0．5mL，作防腐剂。试剂应至少满足但不限于如下标准：GB／T 683—2006《化学试剂 甲醇》、HG／T 4581—2013《化学试剂高效液相色谱淋洗液甲醇》。3．仪器或其他用具载玻片、盖玻片、滤纸、显微镜等。四、操作步骤1．湿墨水法1)制备茵和黑色素混合液加一滴黑色素于洁净的载玻片上，然后挑取少量菌体与其混合均匀。也有用墨水和黑色素替换的。墨水和黑色素都属于混合物，可以溶液替换。2)加盖玻片将一洁净盖玻片盖在混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，轻轻按压以吸去多余的混合液。加盖玻片时勿留气泡，以免影响观察。3)镜检用低倍镜和高倍镜观察，用相差显微镜观察效果更好。背景灰色，菌体较暗，菌体周围明亮的透明圈即为荚膜。2．干墨水法1)制混合液加一滴6％葡萄糖液水溶液于洁净载玻片的一端，然后挑取少量菌体与其混合，再加一杯黑色素，充分混匀。玻片必须洁净无油迹，否则，涂片时混合液不能均匀散开。2)制推片另取一段边缘光滑的载玻片作推片，将推片一端的边缘置于混合液前方，然后稍向后拉。当推片与混合液接触后，轻轻左右移动，使之沿推片接触的后缘散开，之后以大约30。角迅速将混合液推向另一端，使混合液铺成薄层(图2—14)。