婴儿食品中农残的快速筛查、鉴定和定量分析检测方案(气质联用仪)

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样品前处理 Cristian Cojocariu，1 Dominic Roberts，1 Michael T. Hetmanski，? Richard J. Fussell， and Paul Silcock1Thermo Fisher Scientific， Runcorn， UK 2Food and Environment Research Agency (FERA)， York，UK 关键词 婴儿食品；精确质量；筛查；食品安全； GC Orbitrap；高分辨GC-MS；农残分析；定量分析； TraceFinder 前言 农药是广泛用于控制虫害的化学物质，可以用于昆虫、植物病害和野草等对农业生产造成危害的生物。 农药使用后可能会在作物上残留下来，因此，对这类化合物的使用都会进行严格的监管，以确保残留不会超过规定允许的最大残留水平(MRLs)1。 农药分析大都使用基于液相色谱(LC)和气相色谱(GC)方法进行的。GC与质谱(MS)联用仪被农残检测实验室广泛使用，因为许多农药并不适合用 LC-MS分析，或是在“软”电离的条件下离子化效率不高。GC的分离效率比较好，并且有包括单四极杆或三重四极杆在内的多种质谱检测器可以选择。四极杆质量分析器是一款选择性、灵敏度、经济性都非常好的质量分析器，不过只能达到单位质量分辨率(nominalmass resolution)。当使用四极杆质谱仪时，通过选择离子监测(SIM)或选择反应监测(SRM)即可实现目标农药与化学背景的选择性分离。SIM 和 SRM 皆适用于定靶分析实验，在这类分析中通常会根据一个预先确定好的农药列表对质谱仪进行一些参数设定。这样一来，在分析中就确定了要监测的化合物，从而限制了分析的范围，并对未知及未定靶的化合物产出假阴性(未检出)的结果，进而为食品安全带来隐患。 这一局限性促使科学家和业界人士开始不断努力建立新分析方法，使用能够以全扫模式运行、质量分辨率更高、而选择性和定量表现堪比三重四极杆的质谱分析仪。 到目前为止，高分辨精确质量 GC-MS 仪器尚未被广泛接受，主要因为其全扫选择性和定量表现尚无法与以 SRM 模式运行的三重四极杆比肩。 在本研究中，我们使用 GC 与 OrbitrapTM MS 联用技术进行了婴儿食品样品的快速、高通量农残分析。通过进行全扫分析，样品中的农残一览无遗，为分析呈上了一个完整、不受限制的视角。此外，堪比三重四极杆且符合 SANCO 指令的定量表现在本研究中也得到了呈现。 首先根据已发表的方法4，使用柠檬酸缓冲液和 QuEChERS 流程对婴儿食品样品进行萃取。然后向终提取液(1 g/mL， 乙腈为溶剂)中添加132种农药的混合物，其中大部分被分析物的浓度范围为 0.5-100 ng/g (ppb)， 其余为 1.0-200 ng/g. 仪器及方法设置 全部分析均使用Thermo ScientificTM Q ExactiveTM GC 组合四极杆-Orbitrap 质谱仪进行。进样使用的是 ThermoScientificTM TriPlusTM RSH 自动进样器，色谱分离使用 ThermoScientificTM TRACETM 1310 GC， 色谱柱为 Thermo ScientificTMTraceGOLDTM TG-5SilMS 15 m × 0.25 mm l.D. ×0.25 pm薄膜毛细管柱 (P/N： 26096-1301)。更多仪器参数及细节参见下表。 TRACE 1310 GC 参数 进样体积(uL)： 1.0 衬管： 非对称反折型 (P/N： 45352062) 进样口温度(℃)： 75 进样模块及模式： PTV，低温不分流 PTV传输延迟 (min)： 1 进样时间(min)： 0.1 传输速率(℃/sec)： 2.5 传输温度(℃)： 300 PTV 传输时间 (min)： 3 清洁速率(C/sec)： 330 载气及流速(mL/min) ： 氦气，1.2 柱温箱程序 温度1(℃)： 40 保持时间(min)： 1.5 温度2(℃)： 180 升温速率(℃/min)： 25 温度3(℃)： 300 升温速率(℃/min)： 100 保持时间(min)： 3 Q Exactive GC 系统经过调谐和校准(使用校准溶液 [FC 43， CAS311-89-7]中质量数已知的标准品的质谱峰进行)，质量精度达到<0.5 ppm RMS。离子化模式为电子轰击电离(EI)，扫描模式为全扫描，质量分辨率为60，000(峰高一半处的峰宽，在m/z 200处测定)，符合 SANCO 关于高分辨率分析仪器的推荐分辨率标准2。 色谱数据采集确保不小于每个色谱峰不少于12个点，以保证峰面积积分的准确性和重复性。 质谱仪条件 QExactive 质谱仪参数 传输线温度(℃)： 280 离子化模式： EI 离子源温度(℃)： 230 电子能量(eV)： 70 采集模式： 全扫 质量范围(m/z)： 50-500 质量分辨率(FWHM)： 60，000 锁定质量(m/z)： 207.03235 数据采集和处理使用 Thermo ScientificTM TraceFinderTM 软件进行。 TraceFinder 软件允许分析师为高通量筛查和定量分析建立数据采集和处理方法，还包含了谱库检索功能，数据审阅和报告也非常易用。 结果与讨论 本研究的目的是为提高样品通量及实验室生产效率的同时，对基于 Orbitrap 的 GC-MS 技术在农药快速筛查和定量方面的使用效果进行评估。我们评估了多种分析参数，实验结果的详细描述见下。 色谱 使用前述色谱条件即可实现良好的色谱分离。图1给出了相同基质中标品(对应浓度为100/200 ng/g)的色谱峰样图。图示为总离子谱图及第一个(敌敌畏， RT=4.46 min ) 和最后一个(溴氰菊酯， RT = 10.33 min) 洗脱的农药的提取离子谱图(XIC，±2 ppm 质量提取窗口)。如已发表文献所述4，快速分离是高样品通量的必要条件。 当 GC 运行时间较短时，被分析物的色谱峰宽很窄，通常只有2.5秒。在峰宽如此窄的情况下，想要对每个色谱峰得到足够多的扫描点就必须提高质谱采集速率。如果色谱峰的数据采集点不足以确定出一个高斯峰形，目标色谱峰的积分面积就很有可能出错，从而进一步影响分析的重现性、峰形积分、以及目标化合物的定量准确性。使用QExactive GC 系统在 60，000分辨率下对婴儿食品中的 EPTC 进行分析时的典型扫描点分布情况如图2所示。除了采集到足够的数据点之外(每峰17个点)，每次扫描的质量精度都非常好(0.5 ppm RMS)。 农药定靶筛查 我们首先使用添加了农药的婴儿食品进行了一次简单的定靶筛查实验。使用 TraceFinder 软件对个个含有183种农药数据的化合物数据库进行这次分析。数据库里包含了化合物名称，至少3个碎片离子的理论精确质量，以及样品分析使用的色谱条件下的保留时间等信息。化合物检测和鉴定基于保留时间(±0.1 min 窗口)、精确质量信息(±2 ppm窗口)、同位素峰分布的相似度(理论与实际检测)，以及谱库检索结果(NIST 2014) 进行。通过使用这些比对信息，我们成功的在婴儿食品样本中检出并确认了所有132个农药化合物(10/20ng/g)。 图1.总离子谱图(El全扫描)和第一个(敌敌畏， RT = 4.46 min)及最后一个(溴氰菊酯， RT = 10.33 min) 洗脱的农药的提取离子谱图(XIC)的叠加图。对“相对丰度””(Y轴)进行了调整以突出敌敌畏和溴氰菊酯的 XIC 图。 min 图2.狄氏剂的提取离子谱图(XIC))(m/z 262.85642，±±2 ppm 质量窗口)，每峰17个扫描点(峰宽2.4秒)。数据采集在全扫描模式下进行，分辨率为60，000 FWHM(精确分辨率见红字注释)。每个扫描点测得的精确质量及质量差异(ppm)已标注。 0.49 = FERA_132_final 萨口 Selected MZ RT + IP口 FI -1Flag Compound Nar Match Result Name石 Formula Adduct口 Confirmed m/z (Expected-r 1 Aa Aa Aa Aa Aa 2-phenylphenol 2-phenyIphenol@RT 5.35 C12H100 M+ 2 out of 2 170.07 Acetochlor Aclonifen Aldrin Acetochlor@RT 6.54 C10H12N M+ 2 out of 2 5 Benalaxyl Aclonifen@RT 7.95 C12H9CIN2O3 M+ 2 out of 2 146.1 264.03 6 BHC， Alpha BHC， beta BHC， gamma Bifenox Bifenthrin Aldrin@RT 6.97 (12)C7(35)CI4(37)CI1H2 M+ 2 out of 2 7 C10H14N M+ 2 out of 2 8 回 2 out of 2 9 2 out of 2 10 2 out of 2 Spectrum Spectrum ● Isotopes 100% (9 of 9) Fragments (2 of 2) ● All Isotopes Scan#： 1685-1694 RT：6.95-6.99AV： 10 Score： 100 28Nov2014_25 F：FTMS+pEl Full lock ms [50.00-500.00] 3 100 262.27 261.06 *2 264.17 268.00263.16 *4 265.13 *8 *9 #3 1003 50-TTTT3 #1 #5 50] #7 #2 #4 #6 #8 #9 261 262 263 264 265 266 267 268 269m/z ● Multi-Isotopes ●#1：260.85937 ●#2：261.86272 ●#3：262.85642 ●#4：263.85977 ●#5：264.85346 ●#6：265.85682 ●#7：266.85052 Q#8：267.85388 ●#9：268.84756 -4X 图3.10 ng/g 样本中确定鉴定出的农药显示在 TraceFinder 软件筛查结果浏览器中。化合物识别和确认(以艾氏剂为例)的依据是准确质量(±2ppm质量窗口)、保留时间(RT)、同位素峰分布(IP)和碎片离子(FI)。图中可见测定的与理论的同位素峰。 图3以艾氏剂为例展示了化合物检测和鉴定工作流程。先将全扫模式下采集的数据解卷积，再使用保留时间和准确质量信息进行化合物鉴定。艾氏剂的鉴定是基于 RT、定量离子和特征碎片离子的精确质量(<0.5 ppm 质量误差)进行的。此外，定量离子的元素组成(C，C，H)也被用于比对理论和实际测得的同位素峰分布的吻合程度。如图3所示，艾氏剂的同位素分布达到了100%吻合，进一步提高了化合物鉴定结果的可靠性。 我们还就 Q Exactive GC 系统对化合物定量的分析表现针对所有132种农药进行了评估。为此目的，我们在0.5-100 ng/g (或 1.0-200 ng/g) 浓度区间内配制了基质工作曲线标样，并针对系统的灵敏度、线性区间、和峰面积重现性进行了评估。此外，我们还在整个浓度区间内评估了目标农药的质量精确度。 灵敏度 几乎对所有农药(95%)都在最低浓度的基质匹配标样(0.5或1.0 ng/g)中实现了成功检测。此浓度下的色谱图实例参见图4。在 5 ng/g 浓度水平，所有化合物的离子比率值与整个工作曲线浓度范围内的离子比率均值的差异不超过15%。 仪器检测限(IDL)估值与峰面积重现性 为评估系统灵敏度，我们计算了每种农药的 IDL。目标农药的IDL指的是在背景噪音之上、系统能够实现稳定、可靠检测的最小信号。这个信号强度的确定是通过使用 5 ng/g(或 10 ng/g)基质匹配样品进行反复(n=10)进样检测，并计入相应自由度下 Student’s-t 检验的关键值(99%置信区间)确定的。本实验测得的峰面积重现性的%RSD 为6%(图5)。 图4.0.5 pg特丁津(柱上浓度)的定量离子与三个确证碎片离子(左)的 XIC 叠加图。每个离子的实测质量及质量误差(ppm)已标注。质谱图(右)突出了定量和确证使用的离子，放大的区域显示了强度最低的碎片离子(m/z 138.07737)，检测的质量精度为0.3 ppm。 图5.所有132种测定的农药在柱上5或10 pg 浓度水平下的绝对峰面积可重现性(%RSD， n=10)。图示为平均 %RSD值(实线)。 能够持续稳定测定准确质量的能力对于农残鉴定和利用仪器的分辨能力保持高度准确将被分析物与基质干扰的区分至关重要5。通过进行一系列重复进样分析(n=10)我们对所有1132种农药检测的质量准确度在5 ng/g (或 10 ng/g， 具体根据化合物确定)浓度水平进行了评估。没有任何被分析物的质量偏差值超过 1 ppm，整体质量准确度的平均值为 0.4 ppm， 为检测的准确度和选择性提供最大信心保障(图7)。 Q Exactive GC 系统农残检测的所有 IDL 均低于欧盟针对婴儿食品规定的典型 MRL。目前绝大部分农药的 MRL 都定为<0.01 mg/kg(10 ng/g)3。我们还与 Thermo ScientificTMTSQTM 8000 Evo 三重四极杆 GC-MS/MS 系统检测相同农药的IDL 进行了比较。本次实验的结泊表明Q Exactive GC 系统充TSQ 8000 Evo GC-MS/MS 系统的灵敏度相当，91%的被测农药IDL<2ng/g(图6)。 图 6. Q Exactive GC 系统(左)与 TSQ 8000 Evo GC-MS/MS 系统(右)分析5 ng/g 基质匹配标样中132种农药的计算IDL99(ng/g)值比较。图中标出了相对于目标化合物总数(132)的农药百分比以及相应的 IDL 区间。 图7.婴儿食品样品中鉴定出的农药在5(或10) ng/g 浓度水平的准确质量测定结果(n=10的平均值)。 我们还在 0.5-100 ng/g(有些被分析物为 1-200 ng/g) 浓度范围内评估了定量响应的线性程度，样品为进行过基质匹配的校准标样，每个浓度水平进行3次平行进样。在所有情况下，决定系数(R?)均>0.99，平均值为R?=0.997，渐近线的回归残差<25%。化合物线性拟合的样例参见图8。 ·即便是在进行快速 GC 分离的情况下， Q Exactive GC 系统能够为大规模农残分析在全扫模式下提供高定量分析表现。 。本系统的高速扫描、高分辨能力、出众的质量精度、以及全扫描模式下的灵敏度帮助分析人员在极低水平下实现准确、可重复农药定量分析。 ·以60，000 FWHM (m/z 200)的常规质量分辨率进行数据采集能够消除同质量化合物的干扰，提高在复杂基质中筛查农药的结果可信度。对所有化合物都持续保证亚 ppm 水平的质量精度，确保化合物鉴定结果可信。 ( ·Q Exactive GC 系统的定量表现足以匹敌 GC 三重四极杆质谱系统。 ) ·Thermo Scientific TraceFinder 软件使得分析人员能够快速、准确地进行高通量筛查和定量分析。 图8.普硫松和苯霜灵在 0.5-100 ng/g 浓度区间内的决定系数(左)和回归残差(%RSD)。 Orbitrap 组 赛默飞小分子质 学俱乐部 谱应用技术群 上海(中国总部) 广州 上海浦东新金桥路27号7号楼 广州东风中路410-412号 沈阳沈阳市沈河区惠工街10号 时代地产中心2405-2406，3001-3004 卓越大厦3109室 北京 成都 )P 香港 北京市安定门东大街28号 成都市武侯区临江西路1号 香港新界沙田，沙田乡事会路138号 新城市中央广场第一座九楼911-915室 ( 参考文献 ) ( 1. Commission Regulation (EU) No 396/2005 on maximumresidue levels of p esticides in o r on food a n d fe e d of plantand animal origin and amending Council Directive 91/414/EC，16.3.2005， p.1-16. ) ( 2. SANCO/12571/2013 ( 2 014)， G uidance document o n analytical quality control and validation procedures fo r pesticide residues analysis in food and feed， 19. 1 1.2013 rev.0. ) ( 3. Commission Directive (EU) No 2003/13/EC amendingCouncil Directive 96/EC on processed cereal-based andbaby foods f o r infants and y oung c h ildren， 1 4 .2.2003， p.33-36. ) ( 4. Thermo S c ientific Application Note 1 0432： Three-FoldIncrease in P roductivity for Pesticide Residue An a lysis inBaby Food Using Fast Triple Quadrupole GC-MS/MS. ) ( Runcorn， U . K. [ O nline] http：//www.thermoscientific.com/content/dam/tfs/ATG/CMD/cmd-documents/sci-res/app/ms/GC-MS/AN-10432-GC-MS-Pesticides-Baby-Food-AN10432-EN.pdf (accessed Apr. 3， 2015). ) ( 5. 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S CIENTIFIC SCIENTIFIC全国服务热线： 支持手机用户)AThermo Fisher Scientific Brand  农药是广泛用于控制虫害的化学物质，可以用于昆虫、植物病害和野草等对农业生产造成危害的生物。 农药使用后可能会在作物上残留下来，因此，对这类化合物的使用都会进行严格的监管，以确保残留不会超过规定允许的最大残留水平（MRLs）1。农药分析大都使用基于液相色谱（LC）和气相色谱（GC）方法进行的。GC与质谱（MS）联用仪被农残检测实验室广泛使用，因为许多农药并不适合用 LC-MS分析，或是在“软”电离的条件下离子化效率不高。GC的分离效率比较好，并且有包括单四极杆或三重四极杆在内的多种质谱检测器可以选择。四极杆质量分析器是一款选择性、灵敏度、经济性都非常好的质量分析器，不过只能达到单位质量分辨率（nominal mass resolution）。当使用四极杆质谱仪时，通过选择离子监测（SIM）或选择反应监测（SRM）即可实现目标农药与化学背景的选择性分离。SIM 和 SRM 皆适用于定靶分析实验，在这类分析中通常会根据一个预先确定好的农药列表对质谱仪进行一些参数设定。这样一来，在分析中就确定了要监测的化合物，从而限制了分析的范围，并对未知及未定靶的化合物产出假阴性（未检出）的结果，进而为食品安全带来隐患。即便是在进行快速 GC 分离的情况下，Q Exactive GC 系统能够为大规模农残分析在全扫模式下提供高定量分析表现。• 本系统的高速扫描、高分辨能力、出众的质量精度、以及全扫描模式下的灵敏度帮助分析人员在极低水平下实现准确、可重复农药定量分析。• 以 60,000 FWHM（m/z 200）的常规质量分辨率进行数据采集能够消除同质量化合物的干扰，提高在复杂基质中筛查农药的结果可信度。对所有化合物都持续保证 亚 ppm 水平的质量精度，确保化合物鉴定结果可信。• Q Exactive GC 系统的定量表现足以匹敌 GC 三重四极杆质谱系统。• Thermo Scientific TraceFinder 软件使得分析人员能够快速、准确地进行高通量筛查和定量分析。