青霉素菌渣中青霉素残留检测方案(快速溶剂萃取)

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DIONEXA partof：ThermoFisherSCIENTIFICRASE-SH-110822 ASE-HPLC 分析检测青霉素菌渣15.8 中的青霉素残留 检测项目 青霉素 仪器设备 ASE350 UltiMate3000 HPLC系统： DGP-3600 WPS-3000 TCC-3000 DAD-3000 参考应用文献 方法开发 车金水 最终审核 叶明立 1.样品前处理方法： 准确酥取 2g菌渣(烘干样品取 1g)， 与石英砂混合均匀后倒入事先垫好玻璃纤维素膜的萃取池(22mL， SST)中， 进行 ASE 萃取。定容至50mL， 过0.45um滤膜，待 HPLC分析。 2. ASE 萃取条件 a.萃取溶剂：50mM KHPO4溶液(pH=6.0) b.萃取温度：40℃ c.预热时间：5 min d.静态萃取时间： 5min e.循环次数：2次 f.吹扫体积：60% g.吹扫时间：90s h.萃取池：22mL SST i.总萃取时间：20min j. 总萃取体积：30mL 3. HPLC条件 a..色色谱柱： Acclaim C18， 120A， 4.6mm*250mm*5um b.流动相：A： 甲醇； B： 50mM KH，PO溶液(pH=3.5) 表1 HPLC溶剂梯度表 时间/min 流动相A 流动相B -5 50 50 0 50 50 25.1 50 50 c.流速：1mL/min d.色谱柱温度：30℃ e检测波长：UV@225nmf 进样量： 10pL 4.标准色谱图和样品色谱图 图1标准样品色谱图(青霉素100ug/mL) 图2原样(湿样)色谱图 图3原样(湿样)色谱图(放大) 图4烘干样品色谱图 图5烘干样品色谱图(放大) 5.实验条件优化 5.1萃取溶剂的选择 本实验分别考察了甲醇、水、50mM KHzPO4溶液(pH6.0)三种溶剂作为青霉素的萃取剂。实验结果表明：以甲醇作为萃取剂时，对青霉素的萃取率很低。以50mM KH2PO4溶液(pH6.0)为萃取剂时，对青霉素具有最高的萃取率。因此，本实验采用50mM KHP04溶液(pH6.0)作为后续实验的萃取剂。 5.2萃取温度的选择 本实验考察了40℃、60℃和80℃三个温度作为萃取温度对青霉素萃取的影响。实验结果表明：随着萃取温度的增加，青霉素率下降，可能为青霉素受热不稳定降解。本实验采用40℃作为本实验的萃取温度。 5.3衍循环次数的选择 本实验采用 5min 作为静态萃取时间，对同一样品进行了单次循环实验。实验结果表明，第一次萃取循环对青霉素的萃取量占3次萃取量的71.4%；第二次萃取循环对青霉素的萃取量占3次萃取量的24.7%；第三次萃取循环对青霉素的萃取量仅占3次萃取总量的3.9%。所以本实验采用两次萃取循环作为萃取青霉素的萃取循环次数。 图6不同萃取次数对青霉素萃取效率影响 6. 实验结果 6.1色谱数据 本方法分别以2.5、5.0、10.0、25.0、50.0和100.0ug/mL 为标准液溶度，做青霉素标准曲线，得出结果如下表2。 表2标准曲线数据表 No. Peak Name Cal.Type #Points Rel.Std.Dev.% C Coeff.Det. % Offset Slope 1 青霉素 LOff 6 1.4554 99.9895 -0.0002 0.0689 图7标准曲线图 表3平行进样色谱峰数据(n=3) Sample No. Sample Name Ret.Time Area Height Amount Plates /min /mAU*min /mAU /ug/mL (EP) 1 烘干样品 8.833 0.5096 3.5031 7.3951 22754 2 烘干样品 8.830 0.5073 3.4620 7.3631 22519 3 烘干样品 8.823 0.4971 3.3849 7.2141 22538 Average： 8.829 0.5047 3.4500 7.3241 22604 Rel.Std.Dev： 0.058% 1.320% 1.739% 1.319% 0.578% 图8同一样品平行性实验(n=3) 6.2加标回收实验数据 同时本实验分别对原样和烘干样品进行加标回收实验，实验结果见表5： 表5加标回收实验数据 样品 本底值 加标值 实测值 回收率 /ug/mL /ug/mL /ug/mL /% 原样 9.65 50.00 58.44 97.6 烘干样品 7.36 50.00 55.13. 95.5 SHI -3 2g/31ml 图9样品及样品加标色谱图(1.样品；2.样品加标) 6.3样品测试数据 本实验对原液样品，烘干样品分别萃取三次，实验结果如下表3. 表4样品实验结果 样品 萃取次数 萃取率/ug/g 平均萃取率/ug/g RSD/% 1 174.0 原液样品 2 189.8 182.4 4.3 3 183.4 1 251.9 251.7 烘干样品 2 261.2 3.8 3 242.1 7.总结 本方法采用 ASE 萃取青霉素菌渣原液及菌渣烘干样品中青霉素，结合 HPLC分析青霉素含量。实验结果表明， ASE 适合萃取菌渣中的青霉素，加标回收率能够达到95.5%-97.6%。对原液样品和烘干样品进行平行萃取，其平均萃取率分别为 182.4pg/g 和 251.7ug/g， 其 RSD分别为4.3%和3.8%，均满足分析要求。 ( 参考文献： ) ( 1. . 苑华，高燕霞，张菁.高效液相色谱法测定青霉素菌丝中青霉素的残留.中国药业， 2009，18(13)：26-27 ) 本方法采用 ASE 萃取青霉素菌渣原液及菌渣烘干样品中青霉素，结合 HPLC 分析青霉素含量。实验结果表明，ASE 适合萃取菌渣中的青霉素，加标回收率能够达到 95.5%-97.6%。对原液样品和烘干样品进行平行萃取，其平均萃取率分别为 182.4µg/g 和 251.7µg/g，其 RSD分别为 4.3%和 3.8%，均满足分析要求。