水体检材中杀螟松检测方案(固相萃取仪)

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Raykol Applications Collection-RKFT-W007 全自动固相萃取-气质液质检测水体检材中农药类毒物 身处海峡西岸的福建，淡水及海水养殖业十分发达，近年来经济规模也很大，随着淡海水养殖产业的发展，以破坏生产经营为目的，或是污染排放农药类毒物造成淡水或海水养殖产品中毒死亡的事件明显增多。此类事件小则损失几万元，多则几百万元上千万。该类养殖业中毒案事件中，水的基质相对干净，是查清是否农药中毒的理想样本。但是由于案发水域水体面积大，小则几亩多则上百亩，加之养殖户发现大面积鱼体死亡，进行大量换水，使得水体检材中农药类毒物含量更趋微量。本文基 于以上考虑，建立了采用全自动固相萃取、GC/MS、LC/MS/MS 定性定量同时测定淡海水养殖业中毒案事件水样中55种农药的方法。本方法采用OasisHLB 固相萃取柱富集水样，二氯甲烷洗脱，利用 GC/MS 和 LC/MS/MS 进行定性定量；步骤简单，线性响应良好，干扰小，方法检出限为0.002ug/L~0.263pg/L，平均回收率在 64.37%~118.76%之间(除甲胺磷与乙酰甲胺磷)， RSD 小于 14.8%，符合分析与鉴定要求。 55种农药类标准物质均购于国家标准物质中心，浓度为100mg/L。详细物质分类见表-1。 表-1.55种农药标准物质分类 有机磷类 乐果、氧化乐果、甲胺磷、乙酰甲胺磷、敌敌畏、对硫磷、甲基对硫磷、马拉硫磷、丙溴磷、毒死蜱、二嗪磷、伏杀硫磷、杀螟硫磷、甲拌磷、甲基异柳磷、辛硫磷、特丁硫磷、水胺硫磷、亚胺硫磷、三唑磷 拟除虫菊酯类 醚菊酯、联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、氟氰戊菊酯、氟胺氰菊酯、溴氰菊酯 氨基甲酸酯 异丙威、仲丁威、甲萘威、呋喃丹、灭多威、涕灭威、涕灭威砜、多菌灵 有机氯类 五氯硝基苯、硫丹 除草剂 丁草胺、二甲戊乐灵 菌剂 烯酰吗啉、异稻瘟净、乙烯菌核利、嘧霉胺、三唑酮、腐霉利、抑菌脲、苯醚甲环唑、咪鲜胺 杀虫剂 虫螨腈、哒螨灵、吡虫啉、定虫脒、噻虫嗪 水，分别以5 mL/min 的速率活化/平衡 HLB固相萃取柱，备用。取水样滤液加入 5mL 甲醇，，l以10mL/min 的速率经 HLB 固相萃取小柱富集后，再用10 mL水淋洗固相萃取柱；用10mL二氯甲烷以1 mL/min 的速率洗脱，固相萃取程序如图-1所示，用上述浸泡滤膜的二氯甲烷溶液，清洗样品瓶瓶壁，用无水硫酸钠除水后与洗脱液合并，氮吹定容至1mL，取其中0.5 mL 供 GC/MS 检测，剩余部分加入10mL甲醇，吹至近干，使用20%甲醇水定容至1mL， 供LC/MS 检测。详细的流程请见下图所示。 3.2固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 睿科Fotector Plus/Auto SPE 系列 固相萃取柱 HLB以及Sep pak C18固相萃取柱(Oasis， 500 mg/6 mL) 活化 甲醇 淋洗 纯水 洗脱 二氯甲烷 序号 命令 溶剂 排出 流速(mL/min) 体积(mL) 时间[minJ 1 活化 CH2C12 废液1 20 5 1.1 2 活化 CH30H 废液1 3 5 2.1 3 活化 H20 废液1 3 7 2.8 4 大体积上样 废液2 10 1000 150.3 5 淋洗 H20 废液1 5 10 2.6 6 气推 废液1 20 10 1.3 吹干 23 8 清洗注射泵 CH30H 40 2 0.4 9 清洗注射泵 CH2C12 40 2 0.6 10 洗脱 CH2C12 收集 1 10 11.3 11 气推 收集 2 2 1.4 12 气推 收集 20 10 1.3 13 结束 图-1.Fotector Plus 水中农药毒物固相萃取方法 4.1气相色谱质谱联用条件 进样量：2uL；进样口温度：280℃；进样模式：不分流进样。分流出口吹扫流量：60mL/min，0.75 min 分流出口打开；隔垫吹扫流量：3 mL/min；载气节省模式：20mL/min，等待时间2 min；载气：氦气流速=1.0 mL/min；升温程序：初温60℃保持2 min， 以20℃/min 升温到140℃保持1 min， 再以2℃/min 升温到150℃， 保持6 min，以2°C/min 升到170℃，保持6 min，以2℃/min 升到180℃，保持 5 min， 以6℃/min 升到210℃， 保持3 min，再以10℃/min 升温到280℃， 保持6 min. 离子源温度：230℃，质量分析器温度：150℃，辅助加热：290℃。采集方式：选择离子监测模式(SIM)；电子倍增器电压：相对电压200V， 总电压1671V。 4.2气质联用的保留时间及定性定量离子 表-2.43种化合物气相色谱/质谱联用仪保留时间以及特征离子 序号 化合物 保留时间 定量离子 离子 1 离子2 序号 化合物 保留时间 定量离子 离子1 离子2 1 敌敌畏 7.496 109 185 22 二甲戊乐灵 38.14 252 162 2 异丙威 12.707 121 136 23 腐霉利 40.465 283 96 3 仲丁威 14.936 121 150 24 硫丹 41.344 241 195 4 甲拌磷 18.542 75 121 25 丁草胺 44.182 176 160 237 5 克百威 21.052 149 164 26 丙溴磷 45.696 337 374 139 6 五氯硝基苯 22.058 237 249 295 27 硫丹 47.772 241 195 7 特丁硫磷 22.471 231 153 28 醚菊酯 48.005 206 131 116 8 嘧霉胺 23.34 198 199 29 虫螨腈 48.699 59 9 二嗪磷 24.092 137 179 304 30 三唑磷 51.283 161 257 285 10 百菌清 24.505 266 268 31 亚胺硫磷 54.571 160 11 异稻瘟净 25.595 91 204 122 32 异菌脲 54.693 314 316 187 12 甲基对硫磷 27.789 263 109 125 33 胺菊酯 55.154 164 123 13 乙烯菌核利 28.169 285 212 198 34 联苯菊酯 55.18 181 164 14 甲萘威 28.518 115 144 35 甲氰菊酯 55.35 181 209 265 15 杀螟松 31.342 277 260 125 36 伏杀磷 56.054 182 367 16 马拉硫磷 33.289 173 127 158 37 氯氟氰菊酯 56.928 181 197 208 17 毒死蜱 34.126 341 197 258 38 哒螨灵 57.987 147 364 18 对硫磷 34.206 291 139 155 39 氯氰菊酯 59.21 163 181 19 三唑酮 34.692 208 128 181 40 氟氰戊菊酯 59.57 199 181 157 20 水胺硫磷 35.116 121 136 230 41 氰戊菊酯 60.277 419 167 181 21 甲基异柳磷 37.637 199 231 241 42 氟胺氰菊酯 61.185 181 250 43 溴氰菊酯 62.329 181 253 4.3液质联用部分仪器条件 色谱柱： ZORBAX Eclipse Plus C18；柱温：35℃；进样量：10uL；流动相A为4 mmol/L 乙酸铵(含0.1%甲酸)，流动相B为乙腈；流速：0.3 mL/min；梯度洗脱： 0-1min， 10%B， 6-9.5 min 75%B，9.51-12 min， 95%B， 12.01-16， 10% B； Iron Source： ESI；Capillary： 4000V； Delta EMV： 300； Gas Temp：350℃； Gas Flow：10L/h；扫描模式正离子扫描MRM。按照该条件进行检测得到 TIC 图如下图-2所示。 图2.24种化合物液相色谱/质质联用仪 TIC 图 4.4液质MRM参数 表-3.LC/MS/MS 保留时间以及质谱参数 序号 化合物 保留时间 母离子 子离子 驻留时间 碎裂电压 碰撞能量 16 多菌灵 2.804 192.1 160.1 10 110 18 132.1 10 110 30 17 乙酰甲胺磷 1.482 184.1 143 10 135 5 95 10 135 20 18 灭多威 3.715 163.2 106.1 10 60 4 88.1 10 60 2 19 甲胺磷 1.296 142.1 125.1 10 110 8 94.1 10 110 10 20 涕灭威 5.637 116 89.1 10 80 6 70.2 10 80 6 5.方法可行性验证 本文建立的方法其准确性与精密度采用加标回收率与相对标准偏差(RSD)进行衡量。在空白水样中分别添加浓度为0.1 ug/L、0.5 ug/L、1ug/L的55种农药类毒物，按照上述3.2方法进行固相萃取操作。实验结果表明：3个浓度的不同除草剂的平均回收率在64.37~118.76%之间(除甲胺磷与乙酰甲胺磷)， RSD 小于14.8，符合分析与鉴定要求，其中0.5 ug/L 加标回收率如表-4所示。 表-4.0.5 pg/L 加标回收率及 RSD (%) 化合物 平均回收率/% RSD/% 检测下线(ug/L)N=10001 倍S/N 敌敌畏 74.56 10.04 0.023 异丙威 85.17 14.57 0.065 仲丁威 98.07 14.80 0.071 甲拌磷 66.75 2.99 0.120 五氯硝基苯 70.22 10.03 0.054 特丁硫磷 77.45 13.85 0.031 嘧霉胺 115.45 10.78 0.042 二嗪磷 112.60 6.24 0.063 异稻瘟净 108.18 12.69 0.054 甲基对硫磷 86.22 8.45 0.174 乙烯菌核利 98.42 2.37 0.108 杀螟松 76.05 7.40 0.171 马拉硫磷 83.43 7.46 0.065 对硫磷 85.63 9.08 0.190 毒死蜱 85.71 4.39 0.033 三唑酮 101.26 7.58 0.223 水胺硫磷 73.99 8.04 0.053 甲基异柳磷 98.03 7.70 0.092 二甲戊乐灵 75.46 7.66 0.069 腐霉利 86.92 13.91 0.052 A-硫丹 82.68 7.71 0.169 丁草胺 89.21 21.65 0.040 丙溴磷 78.95 4.91 0.162 醚菊酯 108.34 9.82 0.012 虫螨腈 98.67 0.86 0.067 三唑磷 77.20 9.67 0.093 亚胺硫磷 66.32 9.62 0.014 异菌脲 46.69 6.36 0.066 联苯菊酯 77.53 9.02 0.003 甲氰菊酯 94.73 7.78 0.049 胺菊酯 83.35 7.63 0.037 氯氟氰菊酯 64.37 4.11 0.091 哒螨灵 78.20 9.23 0.054 氯氰菊酯 68.11 12.80 0.263 氟氰戊菊酯 75.40 11.70 0.055 烯酰吗啉 118.76 11.14 0.095 溴氰菊酯 79.78 6.09 0.092 氟氨氰菊酯 89.94 13.65 0.040 氰戊菊酯 93.49 11.40 0.092 伏杀硫磷 84.20 12.23 0.020 乐果 89.22 1.88 0.009 甲胺磷 12.52 9.80 0.087 苯醚甲环唑 103.31 10.58 0.011 噻虫嗪 110.57 2.01 0.023 灭多威 117.41 6.56 0.008 克百威 89.36 10.90 0.009 甲萘威 73.82 6.15 0.005 多菌灵 75.44 1.12 0.002 定虫咪 105.63 0.15 0.002 吡虫啉 104.97 3.73 0.025 乙酰甲胺磷 19.73 6.22 0.150 涕灭威 86.52 7.23 0.095 涕灭威砜 83.06 4.95 0.054 辛硫磷 71.57 8.42 0.034 咪鲜胺 101.44 6.49 0.005 6.结果与讨论 6.1检测器分类 本文将55种化合物配成混合标准品，分别用GC/MS 和LC/MS/MS 进行检测，根据响应值进行如下分析： 6.1.1有机磷类农药 甲胺磷、乙酰甲胺磷、辛硫磷、乐果和氧化乐果具有难挥发性、热稳定性差的特点，在 GC/MS灵敏度及响应较低的情况，采用 LC/MS/MS 检测；其他部分有机磷农药采用 GC/MS检测。 6.1.2氨基甲酸酯类 该类化合物极性较强、热稳定性较差，在气相分析温度下易发生分解；采用 GC/MS 检测，只有异丙威与仲丁威的响应比较高，其他物质响应低或无响应；故氨基甲酸酯类采用 LC/MS/MS 进行检测。 6.1.3有机氯以及拟除虫菊酯 该类化合物 GC/MS 上的响应值较好。因此这一部分可以放在 GC/MS 上进行监控，另外氯氰菊酯以及溴氰菊酯在 GC/MS 上响应值较差，因此建议在前处理时增加浓缩倍数。 6.1.4 杀菌剂以及除草剂 该类化合物除了咪鲜胺在 GC/MS 上的响应值比较差，其他化合物在GC/MS上都有比较好的响应，因此采用 GC/MS (咪鲜胺除外)进行检测。 6.1.5杀虫剂 该类化合物在 GC/MS 上的响应值都比较低，在 LC/MS/MS上都有一定的响应值，因此采用LC/MS/MS 上进行建立谱库监控。 6.2固相萃取柱的对比 进行水中的农药毒物残留物分析中，多数情况下应该选择反相固相萃取或者是以反相固相萃取 为主要作用力的混合型固相萃取柱来进行检测，另外可电离的化合物则可以考虑用离子交换柱进行固相萃取如百草枯，草甘膦等，因此结合本次试验的目标化合物，选择了 HLB 固相萃取柱以及 C18固相萃取柱进行比较，另外由于固相萃取柱的柱效(理论塔板数的问题)，经过对比，最终选择 OasisHLB 以及 Sep pak C18 两种规格。 根据试验数据进行比较，发现 HLB 固相萃取柱在进行有机氯与拟除虫菊酯的萃取上同等情况下回收率略低于 C18 固相萃取柱，甲胺磷、乙酰甲胺磷在 C18柱上基本没有回收率，在 HLB 固相萃取柱上回收率约为10%左右，乐果，氧化乐果、噻虫嗪、灭多威、涕灭威亚砜等几种物质在 C18 固相萃取柱上的回收率约为 HLB 固相萃取柱上的1/2，而克百威、甲萘威、涕灭威的回收率比 C18固相萃取柱要高一些，从上述的总结发现，中等极性以及弱极性化合物 C18 固相萃取柱的回收率要略高于HLB 固相萃取柱，而强极性的化合物 HLB 柱要优于 C18固相萃取柱，这是因为 HLB 与的非极性作用力要略小于 C18，但是 HLB 添加的辅助基团有比较好的极性作用力吸附，而 C18只有非极性作用力吸附，因此在强极性化合物的情况下，C18不能很好的将其吸附， HLB 可以通过复合作用力进行作用达到吸附的效果。 公安系统一般情况下需要对检材进行有毒物质的筛查，极性以及非极性物质都有可能出现，因此在未知物检测的情况下，应该以通用性固相萃取柱为主，而回收率则成为次要的因素，因此本文最后决定使用 HLB 固相萃取柱进行条件优化。 6.3 pH值对各种目标化合物的影响 本文分别在 pH=3， pH=6.5， pH=10 三个条件下对55种目标化合物进行固相萃取，以探讨在合适的 pH 范围内对水样的处理与保存。 在不同条件下，部分的化合物的回收率差异较大，具体请如下： 碱性条件下(pH=10)部分化合物回收率差，或者几乎没有回收，如有机磷农药，氨基甲酸酯农药，拟除虫菊酯这类的农药随着 pH 值升高迅速的水解，因此在碱性条件下几乎没有回收；如本实验中的敌敌畏，在酸性条件下，平均回收率为 85.2%，而中性条件下平均回收率为74.6%， 而 pH=10时则迅速的降至0.42%。 乐果、呋喃丹等在酸性条件下回收率较差，经过分析，这一类的农药因为含有胺基，如伯胺基或者仲胺基等，在酸性条件下会生成铵根正离子，而离子化合物所产生的库仑力要远远大于 HLB 固相萃取柱与目标化合物产生的极性或者非极性力，因此这一类的化合物在酸性条件下难以在固相萃取 7.仪器优势 睿科 Fotector Plus全自动固相萃取仪具有通用性高、操作便捷、精确性高和高通量等。在进行水体检材中农药类毒物的固相萃取时，能同步进行6个样品处理，自动连续处理60个样品，从活化、上样、淋洗到洗脱等多种基础命令全部实现自动化，同时与高精度注射泵、12通阀、8溶剂通道完美配合，大大提高了仪器精度和可靠性。 全自动固相萃取仪样品净化 柱上吸附而造成回收率较低，如本实验中的乐果，在中性条件下回收率能够达到80.3%，而酸性条件下回收率则只有39.7%，因此这一类的化合物需要在中性条件下进行固相萃取才能保持较好的回收率。 因此本文经过综合考虑，选定在弱酸性(pH为6~6.5)条件下进行固相萃取能够兼顾到所有目标化合物的测定。 6.4过滤对整个检测过程的影响 在实验过程中发现，样品经过过滤后，拟除虫菊酯类以及有机氯类的回收率会有一定程度的下降，浓度越高现象越明显，经过资料查询后分析最终认定，由于拟除虫菊酯以及有机氯类农药在水中的溶解度非常低，当水中含有泥沙，藻类，浮游生物等颗粒物的情况下，容易析出后附着在颗粒物上，但是颗粒物过多会堵塞固相萃取柱，所以需要对样品进行过滤，而附着在颗粒物上的化合物则会被除去造成回收率下降，因此在最终测定时需要对滤膜进行萃取合并后才能阻止这一部分损失。 睿科 Auto EVA-60 全自动平行浓缩仪能一次性平行浓缩60个样，处理样品通量大；能够用便捷的操作软件能将手动浓缩仪的氮吹针下降调整自动化，浓缩效率高，消耗氮气量小；可在手机、电脑等设备进行方法的编辑、修改、控制，操作简单。 全自动浓缩仪样品浓缩 邮箱： info@raykol.com热线：址：： www.raykol.com 邮箱： info@raykol.com网址：： www.raykol.com热线： 本方法采用OasisHLB固相萃取柱富集水样，二氯甲烷洗脱，利用GC/MS和LC/MS/MS进行定性定量；步骤简单，线性响应良好，干扰小，方法检出限为0.002μg/L~0.263μg/L，平均回收率在64.37%~118.76%之间（除甲胺磷与乙酰甲胺磷），RSD小于14.8%，符合分析与鉴定要求。