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细胞增殖检测——MTT法 细胞增殖是指细胞在周期调控的因子下,通过DNA复制等反应,完成细胞分裂的过程。增殖检测一般是分析分裂中的细胞数量的变化,进而反应细胞的生长状态及活性,目前广泛应用于肿瘤生物学,分子生物学,药代动力学等领域。 检测细胞增殖方法 检测细胞增殖的方法很多,目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。 一种是直接的方法,通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。例如:Ki67细胞增殖检测;BrdU细胞增殖检测;EdU细胞增殖检测。 另一种是间接的方法,即细胞活力检测方法,通过检测样品中健康细胞数目来评价细胞的增殖能力。显然,细胞活力检测方法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。例如:MTT法、CCK8试剂盒法,下面就来介绍一下MTT法。 MTT是什么? MTT是一种粉末状化学试剂,全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide,汉语化学名为 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名:噻唑蓝。是一种黄颜色的染料,CAS No. : 298-93-1 MTT原理 检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臢并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臢,用酶标仪在490nm波长处(英文说明书写的是570nm)测定其光吸收值,在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值),来判断活细胞数量,OD值越大,细胞活性越强(如果是测药物毒性,则表示药物毒性越小)。 MTT实验步骤 1、接种细胞 用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板,每孔体积200ul。 2、培养细胞 同一般培养条件,培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。 3、呈色 培养3-5天后,每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS 配)20ul.继续孵育4小时,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO,振荡10分钟,使结晶物充分融解。 4、比色 选择490nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。 MTT实验注意事项 1、选择适当得细胞接种浓度。 2、避免血清干扰:一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。 3、设空白对照:与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致,最后比色以空白调零。 MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间,超出这个范围就不是直线关系, IC50是半抑制率,意思是抑制率50%的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度,然后计算各自的抑制率,以药品的浓度为横坐标,抑制率为纵坐标作图,然后得到50%抑制率时候的药品浓度,就是IC50。要点:药品2倍稀释,多做梯度,做点线图即可! 细胞增殖是指细胞在周期调控的因子下,通过DNA复制等反应,完成细胞分裂的过程。增殖检测一般是分析分裂中的细胞数量的变化,进而反应细胞的生长状态及活性,目前广泛应用于肿瘤生物学,分子生物学,药代动力学等领域。 检测细胞增殖方法检测细胞增殖的方法很多,目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法,通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。例如:Ki67细胞增殖检测;BrdU细胞增殖检测;EdU细胞增殖检测。另一种是间接的方法,即细胞活力检测方法,通过检测样品中健康细胞数目来评价细胞的增殖能力。显然,细胞活力检测方法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。例如:MTT法、CCK8试剂盒法,下面就来介绍一下MTT法。 MTT是什么?MTT是一种粉末状化学试剂,全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide,汉语化学名为 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名:噻唑蓝。是一种黄颜色的染料,CAS No. : 298-93-1 MTT原理检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臢并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臢,用酶标仪在490nm波长处(英文说明书写的是570nm)测定其光吸收值,在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值),来判断活细胞数量,OD值越大,细胞活性越强(如果是测药物毒性,则表示药物毒性越小)。 MTT实验步骤1、接种细胞用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板,每孔体积200ul。 2、培养细胞同一般培养条件,培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。 3、呈色培养3-5天后,每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS 配)20ul.继续孵育4小时,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO,振荡10分钟,使结晶物充分融解。 4、比色选择490nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。 MTT实验注意事项1、选择适当得细胞接种浓度。2、避免血清干扰:一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。3、设空白对照:与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致,最后比色以空白调零。 MTT实验吸光度最hou要在0-0.7之间,超出这个范围就不是直线关系,IC50是半抑制率,意思是抑制率50%的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度,然后计算各自的抑制率,以药品的浓度为横坐标,抑制率为纵坐标作图,然后得到50%抑制率时候的药品浓度,就是IC50。要点:药品2倍稀释,多做梯度,做点线图即可!
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上海远慕生物科技有限公司为您提供《细胞悬液中细胞增殖——MTT法检测方案(化学试剂)》,该方案主要用于其他中细胞增殖——MTT法检测,参考标准《暂无》,《细胞悬液中细胞增殖——MTT法检测方案(化学试剂)》用到的仪器有胎牛血清(无菌采制)、胎牛血清(辐照灭菌) 、胎牛血清(无菌过滤) 。
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