化妆品中双香豆素检测方案(液相色谱仪)

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2 .4 香豆素；化妆品；高效液相色谱法 引言 香豆素类化合物，是一类具有芳香气味的物质，广泛分布于植物。为增强香气，通常添加一定量的香豆素类香料于化妆品中。因此，香料的安全性将直接影响化妆品的安全性。有毒理实验发现，香豆素是大鼠的可疑致肿瘤物；此外，对人体肝脏有损伤。。由于香豆素类化合物具有相同的母体(其母体是由苯环和氧杂环组成的双环化合物，结构式见图1)，因此危害性也较为相似。 香豆素类化合物在化妆品、食品、塑料等行业常被用作香料使用。鉴于香豆素类对人体健康的危害性，美国食品药品管理局 (Food Drug Administration， FDA) 早在1954年就禁止将香豆素用作食品添加剂‘。欧盟早在2000年就提议在化妆品中禁用二氢香豆素、7-甲氧基香豆素、6-甲基香豆素和7-甲基香豆素，并于2009年在化妆品法规Regulation(EC) No 1223/2009 中将双香豆素、环香豆素、醋硝香豆素、二氢香豆素、7-甲氧基香豆素、7-甲基香豆素、4-甲基-7-乙氧基香豆素纳入禁用物质列表；我国最早是在 GB7916-1987《化妆品卫生标准》中规定6-甲基香豆素 图1.香豆素类化合物的母体 的最大允许浓度为0.003%，而《化妆品卫生规范》 (2007版)中明确规定二氢香豆素、双香豆素、7-甲基香豆素、7-甲氧基香豆素、醋硝香豆素和7-乙氧基-4-甲基香豆素为禁用物质58。 测定香豆素类化合物的方法有气相色谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱一串联质谱法(LC-MS/MS)和气相色谱-质谱联用法(GC-MS)；其中，高效液相色谱法是较为简便的方法9-15。国内于2008年在标准 SN/T 2104/2008《进出口化妆品中双香豆素和环香豆素的测定液相色谱法》中采用高效液相色谱/紫外检测法对化妆品中的双香豆素和环香豆素进行了测定。但是该标准只测定双香豆素和环香豆素，且流动相较为复杂。基于多种香豆素已被列入禁用或限用物质，本文拟通过高效液相色谱法建立一种同时测定化妆品中多种香豆素类化合物的简便方法。 仪器Thermo Scientific M DionexM UltiMateM 3000RS四元系统，包括：-LPG-3400RS四元分析泵(具备溶剂脱气功能)-WPS-3000RS 自动进样器(配置100uL定量环)-TCC-3000RS 柱温箱(具备控温功能)-DAD-3000RS (检测池体积 SST 2.5pL)Thermo Scientific Chromeleon色谱系统控制软件，版本6.80或以上 ( 去离子水，18.2 M Q -cm(Thermo Scientific GenPure Pro UV - TOC， P/N 50131948) ) 乙腈 (CH3CN)， HPLC 级(Fisher Chemical， P/N AC610010040) 标准品 双香豆素号((CAS No.： 66-76-2)、环香豆素(CAS No.： 518-20-7)、醋硝豆素 (CAS No.： 152-72-7)、香豆素 (CAS No.： 91-64-5)、7-甲氧基豆素(CAS No.：531-59-5)、6-甲氧基豆素和7-乙氧基-4-甲基香豆素 (CAS No.： 87-05-8)购买于上海安谱科学仪器有限公司。 标准溶液的制备 标准储备液1 分别准确称取0.01g环香豆素、双香豆素、醋硝豆素、7-甲氧基香豆素、6-甲基香豆素、甲基-7-乙氧基豆素七种香豆素标准品，用二氯甲烷：乙完(v：v5：95) 混合溶液定容至10mL， 得到浓度均为1000 mg/L 的香豆素类化合物单标。各取1mL上述浓度为1000 mg/L 的单标于10mL离心管，用乙腈定容至10 ml， 得到至度为100 mg/L的标准储备液1。 标准工作溶液 将标准储备液1用乙腈进行逐级稀释，得到浓度为0.1 mg/L，0.2mg/L， 0.5 mg/L， 1 mg/L， 2mg/L， 5 mg/L， 10 mg/L， 20 mg/L，50mg/L的标准溶液。 样品前处理 样品 分别称取两种不同的化妆品试样0.1g至聚四氟乙烯容器中，加入3mL乙腈/0.1M氢氧化钠混合溶液(9：1，v/v)， 在超声波清洗器中超声振荡20 min 后，加入0.03mL浓度为 1.0M的乙酸溶液，并用乙腈/0.1M氢氧化钠混合溶液 (9：1，v/v)定容至5ml， 混匀。取部分溶液放入离心管中，在离心机上于6000 r/min 离心20 min， 离心后的上清液经0.45 um有机滤膜过滤，滤液待测定用。 样品加标 称取其中的一种化妆品品样0.1g至聚四氟乙烯容器中，加入0.5 mL 浓度为 10 mg/L的混标，按照己品前处理步骤与样品同步处理。 色谱条件 色谱柱： Acclaim 120， C18，3 pm (3.0×150 mm) (P/N 063691) 流动相：乙腈/水 进样体积：1pL 流速：0.425mL/min 柱温：30℃ 检测：紫外吸收波长，入306 nm 图2.7种香豆素类化合物在同种规格 C18 和 Phenyl 柱的分离对比图 图3.香豆素混合标准品的重叠色谱图(10mg/L，n=8) 图4.空白、标样(1mg/L)、样品、样品加标(加标浓度：1mg/L)的色谱图 图5.空白、标样、样品的色谱图 化合物名称 线性方程(R) 相对标准偏差 (保留时间) 相对标准偏差 (峰面积) 检出限 (3倍S/N) 环香豆素 v=0.0001x+0.0007(R=1) 0.07% 1.28% 26 ug/L 双香豆素 Y=0.0001c-0.014(R=1) 0.08% 1.16% 27 ug/L 香豆素 y=9E-05c+0.0051(R=1) 0.09% 1.13% 17 ug/L 7-甲氧基香豆素 y=12401c-133.9(R=0.9998) 0.09% 1.30% 37 pg/L 6-甲基香豆素 y=0.0001x-0.0045(R=0.9999) 0.08% 1.02% 27 ug/L 4-甲基-7-乙氧基豆素 Y=0.0001c-0.0173(R=1) 0.06% 1.19% 28 ug/L 色谱柱的选择 基于香豆素类化合物的化学性质，本文在相同实验条件下比较了双香豆素、环香豆素在同种规格的 Phenyl 和C18分析柱的分离情况。由图2可知，在该条件下，香豆素类化合物在 C18色谱柱的分离效果更好。 重现性、检出限和线性 为验证方法的重现性，本文通过连续八次进样浓度为 10 mg/L的混标，得到各个香豆素类化合物的保留时间和峰面积的相对标准偏差 (RSD)，保留时间和峰面积的 RSD 分别小于0.1%和2%，说明该方法具有良好的重现性；香豆素、环香豆素等七种香豆素在 0.1 mg/L至 50 mg/L范围内具有良好的线性，所有线性方程R²都大于0.999；另外，按照三倍信噪比可得到各个化合物的检出限，具体结果见图3和表1。 样品和样品加标的分析 为考察方法的可靠性，本文对实际样品进行理论标样浓度为1mg/L的加标，环香豆素、双香豆素、香豆素、7-甲氧基香豆素、6-甲基香豆素、4-甲基-7-乙氧基豆素和醋硝豆素的回收率依次为：80%、90%、89%、94%、84%、92%和89%，说明该方法具有良好的可靠性，见图4。另外，由图5可以看出，七种香豆素类化合物在两种化妆品中均未检出，符合《化妆品卫生规范》标准。 结论 在优化的实验条件下，双香豆素、环香豆素等七种香豆素类化合物在10 min内可完成分析。实验结果表明，该方法具有良好的线性、重现性和回收率，为准确测定化妆品中的香豆素类化合物提供了技术支持。 ( 1. 李明阳.化妆品化学[M]，北京：科学出版社，2002. ) ( 2. l李洁 ， 王超，武婷，李南.高效液相色谱法测定化妆 品中的三种香豆素，日用 化 学工业，2006 ， 36，257- 259. ) ( 3. 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