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自动化样品前处理解决方案-RK-2019-F007 水产品中四环素类化合物的测定解决方案 1.介绍 四环素类抗生素(图1)是由放线菌产生的一类广谱抗生素,由于实用性高且价格低廉,在畜禽养殖和饲料添加剂等方面得到了广泛的应用。近年来,我国水产养殖业发展迅速,鱼类疾病越来越复杂,渔药和抗生素饲料添加剂的使用量也日渐增加。由于药物滥用,导致了水产品中有大量的抗生素残留,严重影响了水产品的质量安全。如果人类长期食用这种抗生素残留的水产品,可能导致牙齿变黄,形成“四环素牙”,甚至会使指甲和巩膜变色,对身体健康产生严重伤害。 本实验参考国标 GB/T 21317-2007《动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法液相色谱-串联质谱法与高效液相色谱法》,建立了基于 Raykol Fotector Plus 固相萃取分析水产品中四环素类抗生素的检测方法。 图1.四种四环素类抗生素结构图 关键字:全自动固相萃取;均质器;;浓缩仪;高效液相色谱-串联质谱法;四环素抗生素 2.仪器与试剂 Raykol Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作站 Raykol Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪 Raykol AH-30全自动均质器 Raykol MPE 高通量真空平行浓缩仪 Raykol AutoEVA-60 全自动平行浓缩仪 Agilent 1260 高效液相色谱(HPLC), Agilent6410 质谱检测器(MS) HLB固相萃取柱 (CNW, 500 mg/6mL) Na2EDTA (0.1 mol/L) -McIlvaine (0.1M) 缓冲溶液(pH4.0), 准确60.2g乙二胺四乙酸二钠,磷酸氢二钠17.8g和柠檬酸21.0g与烧杯中,加入1000mL的纯净水,加入浓盐酸调节pH值至4.0。 3.标准溶液的配制 将1000.0 Hg/mL的单标储备液取出,于室温平衡后用 Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作站配成浓度为0.02、0.04、0.10、0.20、0.50 Hg/mL的标准工作曲线。 甲醇(优级纯),水; 方法结束 4.样品前处理 4.1提取 方法1:称取5g匀浆好的新鲜鱼肉样品于50mL 离心管中,分别用20 mL、20mL、10 mL上述Na2EDTA-McIlvaine 缓冲液漩涡1min,冰水浴超声10 min, 提取三次;3000 r/min 离心后合并上清液,定容至50 mL, 混匀。再次以6000 r/min 离心(温度低于15℃),用快速滤纸过滤;准确量取 10 mL上清液转移至 Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪上样瓶中待净化。 方法2:准确称取搅碎后的新鲜鱼肉样品5.0g于50mL离心瓶中,加入2.0g无水硫酸钠,加入20 mL乙腈进行提取,用AH-30 全自动均质器均质1.0 min, 4000 rpm离心5.0 min, 取上清液于250mL 分液漏斗中。残渣用20 mL 乙腈重复提取一次,合并2次提取液。往分液漏斗中加入20 mL乙腈饱和的正己烷,振摇20 s, 静置取下层乙腈溶液。将所得乙腈溶液于 MPE 高通量真空平行浓缩仪浓缩至 近干,加入10 mL 的 Na2EDTA(0.1 mol/L)-McIlvaine(0.1M)缓冲溶液(pH=4.0), 摇匀备用。 4.2 固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 固相萃取柱 活化 淋洗 洗脱 Fotector Plus高通量全自动固相萃取仪 HLB (Waters, Oasis, 500 mg/6 mL) 甲醇 pH 4.0甲酸水溶液 甲醇溶液 4.3净化 分别以5mL甲醇和5mL水活化 HLB 柱 (Oasis500 mg/6mL)后,将上述提取液以1 mL/min的速度进行上样,并用3mL水清洗样品瓶。以5 mL 水和5mL5%甲醇水对固相萃取柱进行淋洗。在 20 psi的氮气流下吹干 HLB柱,最后以10 mL甲醇洗脱目标化合物(具体的净化步骤请见图2)。将所得洗脱液在 AutoEVA-60 全自动平行浓缩仪上浓缩至近干,以30%甲醇水溶液定容至1mL,上机测试。 序号 命令 溶剂 排出 流速(mL/min) 时间(min) 1 清洗样品通道 CH30H 4.3 2 活化 CH30H 有机废液 5 5 1.4 3 活化 H20 有机废液 5 5 1.4 4 上样 有机废液 1 10 10.8 5 清洗样品瓶 H20 有机废液 60 3 3.8 6 淋洗 H20 有机废液 2 5 2.9 7 淋洗 5%CH30H-H20 有机废液 2 5 2.9 8 气推 有机废液 80 10 0.9 9 吹干 5 10 清洗注射泵 CH30H 40 5 0.6 11 洗脱 CH30H 收集 2 10 5.6 12 气推 收集 80 10 0.9 13 结束 14 图2.Fotector Plus 四环素固相萃取净化方法 5.检测条件 5.1色谱柱条件 检测器 Agilent 6410 离子模式 ESI 吹扫气 11 L/min 氮气温度 350℃ 簇电压 4000 雾化压力 35 psi 梯度洗脱 0.0-0.50 min, 80%流动相A; 0.50-2. 0 min, 30%流动相A; 2.0-4. Omin, 30%流动相A; 4.00-4.10 min, 90%流动相A; 4.10-7.0min, 90%流动相A。 5. 2 MRM参数 表1.4种四环素的串联质谱检测参数 Compound Name Precursor Ion Product Ion Dwell Fragmentor Collision Energy Cell AcceleratorVoltage 四环素 445.2 427.1 40 120 6 7 410.1 40 120 14 7 154 40 120 26 7 土霉素 461.2 443.2 40 115 8 7 426.1 40 115 12 7 金霉素 479.2 444.1 40 120 18 7 462 40 120 12 7 强力霉素 445 428.1 40 125 14 7 321.1 40 125 30 7 267.1 40 125 38 7 5.3 MRM 色谱图 下图为四种四环素类化合物标准溶液在液质上的质谱图: 6.样品测试 6.1基质效应验证 为了消除基质带来的离子抑制对定量测定的影响,需用空白样品提取液来配制标准工作曲线。如果基质加标浓度准确,则可以直接用标准曲线对样品进行定量;如果不准确,请使用基质加标做工作曲线进行定量。 表2所示,4种四环素回收率在75-115%之间,RSD 值均控制在10%以内。说明该方法能够很好地 选择定量离子的峰面积作为纵坐标,浓度作为横坐标,做相关曲线,曲线为线性回归,各点权重相等,拟合出工作曲线,要求R>0.995;此曲线两周需要重新配置一次。 6.2样品基质加标测试 为了验证该方法的回收率,本实验向新鲜鱼肉样品(5g)中加入上述4种四环素类标准品(40uL,1mg/L),进行加标回收验证(n=3)。测试结果如运用于水产品中4种四环素的检测。 表2.新鲜鱼肉中的加标回收率及 RSD 值(40 ng/kg) 化合物 回收率(%) 回收率(%) 回收率(%) 平均回收率 RSD(%) (Compound) 样品-1 Sample-1 样品-2 Sample-2 样品-3 Sample-3 Average Recoveries (%) 四环素 111.94 102.13 113.26 109.11 5.57 土霉素 110.84 94.31 107.82 104.32 8.44 金霉素 78.67 76.70 79.70 78.36 1.95 强力霉素 76.61 87.95 80.38 81.65 7.08 7.结果与结论 7.1样品提取过程中可以采用两种方式进行提取,但最终都必须以 Na2EDTA-McIlvaine 缓冲液进行 pH 值调节后,方可进行固相萃取柱净化。否则四环素类化合物容易与样品中含有的微量金属元素络合,导致其在固相萃取柱上无法保留,最终使得加标回收率较低。 7.2对于洗脱液的氮吹应控制在近干状态,不可氮吹至干,否则容易导致回收率较低。 8.解决方案的优势 睿科 AH-30全自动均质器实现多任务的高通量均质,完全取代了手动均质的过程。一次最多处理32个样品,大大提高工作效率。 睿科 Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作站能够实现混标制备、标准曲线制备、样品添加和分液等液体样品处理功能,全程无需人员值守,极大减轻工作量并且保护实验人员的身体健康;同时仪器程序化运行可以有效避免人为误差,保证曲线的精密性和准确性。 Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪采用全自动操作,可以排除人员操作带来的误差,从活化到上样、洗脱一步到位,六通道同时进行;同时Fotector Plus 能够实现高通量处理,最多一天能够处理180个样品,省时省力,真正为批量检测提供帮助。 MPE 真空平行浓缩仪/AutoEVA-60 全自动平行浓缩仪,大大地提高了样品前处理效率,真正完全解放实验室人员劳动。 全自动均质器 全自动液体样品处理工作站 均质 高通量真空平行浓缩仪 全自动固相萃取仪标曲配制 预浓缩 净化 全自动平行浓缩仪浓缩 热线:箱: info@raykol.com网址::www.raykol.com 邮箱: info@raykol.com热线:址:www.raykol.com 四环素类抗生素是由放线菌产生的一类广谱抗生素,由于实用性高且价格低廉,在畜禽养殖和饲料添加剂等方面得到了广泛的应用。近年来,我国水产养殖业发展迅速,鱼类疾病越来越复杂,渔药和抗生素饲料添加剂的使用量也日渐增加。由于药物滥用,导致了水产品中有大量的抗生素残留,严重影响了水产品的质量安全。如果人类长期食用这种抗生素残留的水产品,可能导致牙齿变黄,形成“四环素牙”,甚至会使指甲和巩膜变色,对身体健康产生严重伤害。本实验参考国标GB/T 21317-2007《动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法 液相色谱-串联质谱法与高效液相色谱法》,建立了基于Raykol Fotector Plus固相萃取分析水产品中四环素类抗生素的检测方法。
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睿科集团股份有限公司为您提供《水产品中金霉素检测方案(浓缩仪)》,该方案主要用于水产品中兽药残留检测,参考标准《暂无》,《水产品中金霉素检测方案(浓缩仪)》用到的仪器有睿科 MPE 高通量真空平行浓缩仪、睿科Fotector Plus高通量全自动固相萃取仪、睿科AH-40全自动均质器、睿科 Auto Prep 200全自动液体样品处理工作站、睿科HPFE高通量加压流体萃取仪。
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