细胞中病毒载体检测方案

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细胞治疗病毒载体制备工艺平台 gehealthcare.com @新崛起的细胞治疗领域为不治之症带来了希望和光明，然而这个全新的领域面临诸多的挑战，3主要来源于法规及安全可控的产业化的挑战，而GE在这方面能最大的助力细胞治疗客户快速发展。 GE在生物制药行业已经超过三十年，了解生物制备工艺，了解市场是如何发展的，并劵并提供了从终端到终端的技术，而且我们的技术已经应用在了细胞治疗刚刚上市的项目上。 我们有细胞的研究和细胞的大规模生产的技术，并且掌握了分析技术可以对于大规模生产的质量进行监控，采用的技术是已经被证明用在生物制药上，而现在只是在细胞领域进行了不同的应用。 GE Healthcare的业务非常广泛，我们对于医药环境的系统设施的熟悉程度为细胞治疗和再生医学这-独特的领域在临床上患者和治疗之间的鸿沟架设了桥梁。我们带来了市场，技术，财务和合作机会。而生物，工程法规框架和供应链物流的复杂相互作用对于细胞治疗开发和商业化是必须的这都向现代的医学提出了独特的挑战，GE的宽广的能力使得我们能应对这些挑战，成为细胞治疗领域解决方案的提供者。 病毒载体和质粒工艺汇总 细胞/基因治疗作为一种“活的”生物药物，!给肿瘤治疗带来了新的曙光。在细胞/基因治疗中一个非常重要的基因转移工具就是病毒载体。 质粒 慢病毒 生产工艺流程 生产工艺流程 大肠杆菌发酵 HEK293细胞培养 或 WAVE 25 XDR10 XDR-50MO 十 质粒澄清、浓缩与纯化 Cytodex Cell boost 5 HyCloneFBS HyClone HyCellM Immune cells are TransFx-H SFM4Transfx-293 collected by a Cytopore media procedure called AKTA flux 6 AKTA avant 150 apheresis 4 plasmids system HEK293 cell CaCl，+H，PO /PEI 将质粒钙转进293细胞 Xuri 25 Immune cell 包装出大量假病毒 amplification 病毒澄清、浓缩与纯化 中空纤维 Capto core 700 AKTA flux s C0.45um，300KDa AKTA avant 150 Capto Q ImpRes 假病毒去感染T细胞， 将CAR基因整合进T细胞的基因组中进行表达 Cells are reinfused into the patient at clinical center Cells are tested for safety and potency and packaged for injection back into the patient cg 工艺与硬件平台的强强联合，保证从研发到生产的无缝链接! 柱子直径(mm) 系统 50 70 100 140 200 300 400 450 600 800 1000 AKTATM PURE 150AKTATM avant 150 AKTApilotTM AKTAprocessTM6mm，3/8” AKTAprocess10mm， 1/2” AKTAprocess1” 1977年，f，Frank Graham博士建立了使用贴壁依赖型呈上皮样人胚肾细胞293细胞株在无辅助病毒的情况下生产重组腺病毒的实验方法。之后，293细胞被发现转录组中存在SV40增强子，而SV40增强子能够帮助细胞提高转染效率。因此，大部分的实验都会通过293细胞株进行质粒的转染，用于生产慢病毒、腺病毒等病毒载体。目前293细胞上游多为细胞工厂的培养方式，限制了工艺的可放大性。 根据培养方式的不同，293细胞的培养可分为贴壁培养和悬浮培养。贴壁培养具有转染效率高、病毒得率高的优势，一次性生物反应器XDR，配合微载体Cytodex1/3的使用，可以满足HEK293细胞的大规模培养的需求。随着技术的发展，HEK293细胞的悬浮培养也获得了成功。在灌流模式下，使用培养基HyCloneM HyCellTM TransFx-H或SFM4Transfx-293 media， 同时配合补料HyClone"HyCloneMCell BoostM5， 病毒滴度可以达到3.2x107。 随着细胞治疗规模的扩大，质粒的生产规模也在逐渐扩大。传统的摇瓶已经无法满足大规模生产的需求。此时，可以使用一次性生物反应器XDR-50MO可以进行大肠杆菌的大体积发酵。 WAVE 25的特点： 波浪式生物反应器，培养体积100 mL-25L； 兼容批次培养，补料培养及灌流培养工艺； 全密闭的环境，病毒培养更安全。 符合FDA 21 CFR PART 11 法规的数据记录。 XDR-50 MO/ 500 MO的特点： 高径比2：1，适合微生物细胞培养； KLa 可达400 mmol·L1h； 更好的混合效果，多搅拌拌，3层挡板； 一次性培养袋，无污染风险，无需CIP及SIP。 XDR的特点： XDR-10至XDR-2000，可用于小规模至大规模的悬浮及贴壁细胞培养。 更稳定的培养环境，包含全水浴夹套， pH， DO双备份监控，， pCO，，质量检测； 针对微载体细胞开发的新型搅拌半和搅拌袋； 强大的延展性，标准系统即可扩展至适用灌流培养，可适用于HEK293细胞的连续病毒收获过程。 HyCloneTM HyCellTM TransFx-HSFM4Transfx-293 media HyClone M Fetal Bovine Serum Cytodex1&3 HyCloneTM Cell BoostM 5 膜过滤系统 -从收集，：澄清到浓缩，换液，整合在下游纯化之中 在病毒载体及质粒的下游工艺中，细胞收获、澄清过滤、样品的浓缩与换液等步骤广泛应用到了以中空纤维为主的切向流过滤技术。根据膜孔径的不同，可为微滤和超滤。一般而言，切向流膜过滤的重点优化参数包括跨膜压力(TMP))、流速、剪切力、通量等关键参数。 AKTA Flux系列可以满足实验室小量样品制备以及大规模生产的膜过滤需求。设备的自动化可以加速对关键参数的摸索和优化，同时可以保证数据完整性。 病毒载体澄清、超滤步骤关键参数汇总 目的 孔径 TMP (bar) Shear rate (S-1) Flux (LMH) 澄清 0.45um <5 4000~6000 50-100 浓缩/超滤 100-750KDa <20 4000 30 中空纤维柱(1Hollow Fiber)的特点： 温和低剪切力 开放式流道结构，容尘量高 产品种类型号齐全：微滤(0.1，0.2，0.45，0.65pm)和超滤(1，3，5，10，30，50，100，300，500，750KDa)均一的膜孔径 物理化学耐受性好 封闭滤柱自带夹具，保证生物制品安全 更低压降提高膜利用率，易于线性放大 滤柱生物安全性符合各项法规要求 AKTA fluxs： 适合早期工艺开发的膜过滤系统 灵活兼容中空纤维和膜包 过滤面积：：16-50cm² 适配中空纤维柱型号：： AXM/AXH型中空纤维 进口流速：PFB管路20-150 mL/min@4bar；PFD管路20-350 mL/min@1.5bar 最小工作体积：PFB管路15ml；PFD管路21ml AKTA flux 6的特点： 为早期工艺开发以及小规模生产而设计的膜过滤系统 卫生级别设计，符合GMP要求 过滤面积：：110-3000 cm² 适配中空纤维柱型号： Size3，4，5，6 进口流速：100-6000 mL/min@4bar TMP范围：0.3-4.0 bar 最小工作体积：R：150mL 灵活的处理允许使用中空纤维滤筒和膜包 AKTA ready flux 的特点： 为中试规模及后期生产而设计的一次性膜过滤系统 符合GMP要求的材质以及文件 过滤面积：0.46-2.5m² 适配中空纤维柱型号： Size 5，6，8，9 流速：2-18L/min @4bar 最小工作体积：600 mL @ 2 L/min 流速下 800 mL@6L/min 流速下 控制软件： UNICORNTM7 支持不同规模的袋子，膜过滤产品，予预留接口，可连接其他设备 一从小试平台到GMP生产平台，满足病毒和质粒纯化的需求 AKTA Avant 150的特点： 用于方法探索和纯化工艺优化的全智全能的层析系统 单泵最大流速：150mL/min；双泵同时运行可到300mL/min 兼容层析柱：：：5-100mm， 支持Axichrom智能装柱 DDoE实验设计：以最少实验次数获得最大数据量，加速工艺开发 Buffer Pro： 在线配置缓冲液 内置半导体可制冷收集器 户软件Unicorn符合FDA 21CFR Part 11对数据完整性的要求；支持IQ/OQ验证AKTA pure 150的特点： 模块化设置，可根据实际需求灵活配制系统，兼容所有的层析技术 单泵最大流速可达150mL/min；双泵同开最大流速可达300mL/min 兼容16-100mm层斤柱 软件界面友好，流路直观，操作简便 软件符合 FDA 21CFR Part 11对数据完整性要求：具有十级权限管理、审计追踪、电子签名等功能 支持IQ/OQ验证 AKTA pilot 600R的特点： 满足早期临床前制备以及小规模生产的层析系统 单泵最大流速：600mL/min；双泵同时运行可到1200mL/min 兼容层析柱：226-200mm内径 台式设计：占地面积小，灵活移动 支持Axichrom智能装柱，，保证高质量装柱效果 卫生级别设计，方便进行清洁验证 符合GMP要求的材质以及文件 验证支持： IQ/OQ； FDA 21CFR Part 11 AKTA ready的特点： 满足早期生产和规模放大的一次性层析系统 流速范围： 3L/h-510L/h 一次性的Flow Kit支持微生物控制和降低污染风险 兼容层析柱：70mm-450mm内径 验证支持：IQ/OQ文件支持 符合GMP要求的材质以及文件 无需清洗或清洗验证 可使用预装柱，预验证，，预消毒的层析柱 AKTA Process： 全自动液相层析生产系统，用于生物药物工艺研究及大规模生产 灵活配置，根据工艺需求和厂房设计提供相应系统 多种流速范围，最大可至2000L/h 和Axichrom合用，实现智能化装柱 卫生级别设计，方便进行清洁验证 符合GMP要求的材质以及文件 Axichrom全自动层析柱 验证支持： IQ/OQ； FDA 21CFR Part 11 层析填料 一有效去除细胞培养中的杂质，提高纯度和生产效率，更多的新产品进入到细胞治疗中 在整个病毒载体生产的下游工艺中，层析占据着核心地位。在新一代层析填料推出之前，分子筛和离子交换是病毒下游纯化工艺的主体。由于对产品质量要求的不断提高，病毒载体的工艺往往会包含两步到三步层析，比如慢病毒载体多为阴离子与分子筛铂组合模式；腺病毒载体的纯化则包含了阳离子+阴离子+分子筛三步层析等。工艺的整体收率也大多限制在层析步骤。为了提高产品质量以及整体的工艺收率， GE推出了新一代层析填料，尤其是Capto core700，已经成为了病毒纯化的首选。 Capto core 700★ Capto core 700是一种多模式层析填料：：具有双层填料结构，将分子筛、离子相互作用、疏水相互作用等多种作用力模式结合在一起。在纯化时，病毒被截留，通过流穿模式进行纯化，而小分子杂质会进入填料内部被多模式配基吸附，从而实现目标病毒与杂质的分离。与其他填料相比， Capto core 700具有高载量、高流速、高纯度、高回收率等多重优势。 Capto core 700结构示意图 Capto core 700在慢病毒纯化上的应用 ★AVB Sepharose High Performance★ AVB Sepharose High Performance是一种亲和层析填料，专为腺相关病毒( AAV)的纯化而设计。该填料的优势在于：有效的，工业化规模的进行AAV(1，2，3，5)的生产；无动物来源成分，降低法规方面的风险；高选择性；良好的可放大性。 AVB Sepharose High Performance结构示意图 AVB Sepharose High Performance在AAV纯化上的应用 CaptoQImpRes 以最新一代高流速琼脂糖为骨架的阴离子交换填料，40pm粒径。与传统离子交换填料相比，具有高流速、高载量、高分辨率的显著优势。 Sepharose 4FF/6FF Sephacry系列分子筛层析填料，通过分子大小进行蛋白分离，病毒纯化的经典填料 质粒纯化三步法层析填料 Sepharose 6FFPlasmidSelectSOURCE 30Q 关于GE医疗集团 GE医疗集团通过提供革新性的医疗技术和服务，开创医疗护理的新时代。我们在医学成像、信息技术、医疗诊断、患者监护系统、药物研发、生物制药技术、卓越运营和整体运营解决方案等领域拥有广泛的专业技术，能够帮助客户以更低的成本为全世界更多的人提供更优质的服务。此外，我们还和医疗行业领袖一道，正努力通过全球政策，打造成功的、可持续的医疗体系。 我们的“健康创想”愿景普及全球。我们不断通过创新在世界范围内推动降低医疗成本、增加医疗机会、提高医疗质量。GE医疗集团总部设在英国，是通用电气公司(纽约证券交易所： GE)下属的业务集团之一。GE医疗集团的员工分布于全球100多个国家和地区，致力于为医疗专业人士和患者服务。欲了解更多有关GE医疗集团信息，请致电客服热线或访问公司网站。 www.gehealthcare.com 全国免费客服热线：：8800-810-9118/400-810-9118 北京办公室上海办公室广州办公室成都办公室北京市经济技术开发区上海市张江高科技园区广州市天河区珠江新城花城大道87号成都市高新西区西芯大道3号同济南路1号华佗路1号通用电气大厦10楼创智联邦3号楼、4号楼邮政编码：100176邮政编码：201203邮政编码：510623邮政编码：611731电话：010-58068888电话：021-38777888电话：020-38157777电话：028-62722345传真：010-67872812传真：021-38777451传真：020-38157797传真：028-62722464 GE在生物制药行业已经超过三十年，了解生物制备工艺 ，了解市场是如何发展的，并提供了从终端到终端的技术，而且我们的技术已经应用在了细胞治疗刚刚上市的项目上。我们有细胞的研究和细胞的大规模生产的技术，并且掌握了分析技术可以对于大规模生产的质量进行监控，采用的技术是已经被证明用在生物制药上，而现在只是在细胞领域进行了不同的应用。·