细胞裂解液，腺相关病毒颗粒中病毒蛋白表达，病毒颗粒的电荷异质性检测方案(蛋白印迹仪)

智能文字提取功能测试中

鉴定衣壳蛋白VP1/2/3 Inter-assay CV 基因治疗：创新多重技术组合，严控腺相关病毒(AAV) 质量 ·基因治疗与 AAV-- 基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，从而达到治疗目的。所有基因疗法都利用病毒或非病毒载体将 DNA 或 RNA 输送到宿主细胞中。与非病毒载体(如阳离子脂质或化学载体)相比，病毒载体感染宿主细胞的效率更高，但同时它们可能具有免疫原性副作用。因此，在开发药物时，选择合适的病毒载体是至关重要的组成部分。腺病毒相关病毒(Adenovirus Associated Virus， AAV)AAV是一类单链线状 DNA缺陷型病毒。其基因组 DNA 小于 5kb， 无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV 不能独立复制，只有在辅助病毒(如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒)存在时，才能进行复制和溶细胞性感染。腺相关病毒(AAV) 作为一种安全有效的载体，目前已应用于多个临床试验。 Primary gene Condition AAV Transgene Strategy Sponsor Phase ClinicalTrials. Dan Wang， Nature Reviews Drug Discovery， 2019 临床研究项目中 AAV1和AAV2约占50% -质量控制-- Wes 全自动定量 Western Blot 在 AAV 生产过程中，使用SDS-PAGE 通过 Western Blot 来鉴定蛋白。然而，传统的Western Blot 手动操作繁琐，重复性差，并且仅是半定量，不宜用于工业产品质量控制。Wes 全自动定量 western 以其独特优势逐渐替换传统western blot，可用于新型 AAV 衣壳的表达到下游制造全程质量控制中。 FIGURE 1. (A) Immunodetection of VP1， VP2 and VP3 proteins during purification from whole-cell lysate. Detection was performed with an anti-AAVVP1/VP2/VP3 mouse monoclonal antibody. (B) Total protein detection of each fraction. Load： input material loaded onto the columns； flow-through： material not bound on columns； wash： wash buffer from columns； fractions： eluate fractions from columns； VR1616： ATCC purified referencematerial loaded as a positive control (low titer)； cell lysate： HEK293 cell lysate (without virus)； water： negative control. Sample dilutions are shown inbrackets.2筛选抗体1，000，000VP3 VP2 VP1800.000600，000Anti-AAV2VP1/VP2/VP3 mouse monoclonal400，000200，000030，000w 25，00020，00015，000Anti-AAV2VP1/VP2 mouse monoclonal10，0005，0000 30，00025，000 20.00015，000Anti-AAV2VP1 mouse monoclonal10，0005，0000 124066116180230MW (kDa)FIGURE 3. Antibody screen targeting VP1/VP2/P3 proteins (top panel)，VP1/VP2 proteins (middle panel) and VP1 only (bottom panel).检测动态范围 FIGURE 4.Range of detection of the anti-AAVVP1/VP2/VP3mousemonoclonal antibody. (A) Lane view of VP1/VP2/VP3 detection of eachdilution. (B) Total peak area of VP1/VP2/VP3 by dilution factor. 将市售AAV2 (1x10" GC/mL， 33.8ug/mL)进行从1：8至1： 256的2X倍比稀释， Wes检测VP1/VP2/VP3。 Maurice 表征 AAV电荷异质性 与所有治疗药物一样，基因疗法，需要表征包装药物的递送载体电荷等。使用全柱成像毛细管等电聚焦电泳法((iclEF) 来表征 AAV 的电荷异质性，可以确保产品的稳定性和一致性。 Maurice 兼具 CE-SDS 和 iCIEF 双功能。两种功能均入选国家药典。 MauriceCE-SDS+iCIEF双功能效率为传统方法5倍自发荧光+紫外吸光度双模式自发荧光灵敏度为吸光度3-5倍免组装毛细管卡盒·方法入选国家药典 自发荧光和紫外吸光度比较 FIGURE 1. Apparent pl comparison of intact AAV2 and AAV6 particles. The intact AAV2 resolves as a single peak just below pl~9.0 (left)while the intact AAV6 resolves as 2 peaks at an apparent pl ~9.25 (right). Native fluorescence detection (bottom) was clearly more sensitivecompared to absorbance detection (top)， making it possible to save precious sample when performing intact AAV analytics. Maurice 同时兼具紫外吸光度和自发荧光检测通道。与吸收检测相比，自发荧光的灵敏度高3-5倍，可以更好检测出 AAV 特征性异构体峰。因而自发荧光模式更适合 AAV 病毒电荷表征。 Intra-assay CV SAMPLE INTACTAAV2 AREA INTACT AAV6 AREA Injection1 47867 34711 Injection 2 43590 36932 Injection 3 47992 34636 Injection 4 46224.50 38318 Mean 1827.69 36149.25 %RSD 3.95 4.30 TABLE 1.1.Quantitative results from the quadruplicate injections ofintact AAV2 and AAV6 demonstrates the intra-assay reproducibilityof the intact AAV method.The results were very reproducible AAV2 和 AAV6 样品一式四份进样，检测 Intra-assay重现性(图2)。结果显示其高重现性： AAV2 和 AAV6的%RSD分别为3.95%和4.30%(表1)。 fluorescence exposure). AAV6样品三次独立实验，：每次实验三次重复，来检测Inter-assay 重现性(图3)。%RSD为6.6%(表2)。 变性 AAV 蛋白电荷表征 FIGURE 4. The denatured iclEF method for AAV2 is reproducible for both absorbance (left) and native fluorescence (right)detection within a run. Shown are overlays of three injections for both detection modes. Data generated with nativefluorescence detection had improved signal-to-noise ratios and baseline resolution compared to absorbance detection. AAV 病毒蛋白会进行几种翻译后修饰，包括糖基化和脱酰胺作用。应激引起的病毒蛋白脱酰胺作用可能导致载体活性，衣壳装配和转导效率降低。iclEF 方法通常用于监测由唾液酸化，糖基化和脱酰胺作用诱导的单克隆抗体的电荷异质性，因此对AAV 病毒蛋白也进行类似的评估。使用一式三份电泳图叠加使用吸光度和自发荧光检测法进行评估， AAV2 电荷变异体可以清晰分辨和重现(图4)。 灵敏度及线性 mL (left) and was detected with as little as 3x10" GC/mL AAV2 using native fluorescence detection. Strong linearity was also observed (right)across the titration range tested with an R? of 0.9956. 将变性的 AAV2 从一3x10”GC/mL 连续滴定至一3x10"GC/mL(图6)以建立方法的灵 敏度。该滴定范围内观察到很强的线性相关性， R²为0.9956。 监测 AAV 颗粒稳定性 FIGURE 7. Intact AAV6 analysis following incubation at varioustemperatures. After 10 minutes at 60 ℃， the AAV6 particle cannotbe observed and is no longer stable. The change in peak signatureafter stress-testing indicates Maurice can be used to monitor viralvector stability. 对完整的 AAV 样品进行温度压力测试，以确定是否可以使用 Maurice 监测病毒载体的稳定性或衣壳蛋白脱酰胺。AAV6 颗粒非常稳定，在37℃ 或 50C 下保持10分钟完整无缺。但是，当AAV6颗粒在60℃下10分钟时，不稳定。 监控AAV批间差 FIGURE 9. AAV6 lot-to-lot comparison. Five different lots of AAV6were analyzed using the intact method. All lots produced a similarprofile at pl~9.25， but only one lot had an additional peak at a lower pl. 利用 Maurice iclEF 天然荧光监测批次间变异，以鉴别病毒载体批间差别。五批不同的AAV6， 每批具有不同的基因组含量/mL (GC/mL)， Maurice iclEF 自发荧光分析(图9)。 结果显示，所有五个批次在 pl一9.25左右均产生相似的峰形。但是，在一批中观察到了一个较低 pl 的附加峰，表明该样品与其他四批样品不同。 主要参考资料 1. Deamidation of amino acids on the surface of adeno-associated virus capsids leads tocharge heterogeneity and altered vector function， AR Giles， JJ Sims， KB Turner， L Govindasamy， MR Alvira， M Lock， JM Wilson， Mol Ther， 2018； 26(12)：2848-2862. 2.Dan Wang， Phillip W. L. Tai and Guangping Gao，Adeno-associated virus vector as aplatform for gene therapy delivery， Nature Reviews Drug Discovery， 2019. 基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，从而达到治疗目的。所有基因疗法都利用病毒或非病毒载体将DNA或RNA输送到宿主细胞中。与非病毒载体（如阳离子脂质或化学载体）相比，病毒载体感染宿主细胞的效率更高，但同时它们可能具有免疫原性副作用。因此，在开发药物时，选择合适的病毒载体是至关重要的组成部分。AAV是一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染。腺相关病毒（AAV）作为一种安全有效的载体，目前已应用于多个临床试验。在AAV生产过程中，使用SDS-PAGE通过Western Blot来鉴定蛋白。然而，传统的Western Blot手动操作繁琐，重复性差，并且仅是半定量，不宜用于工业产品质量控制。Wes全自动定量western以其独特优势逐渐替换传统western blot，可用于新型AAV衣壳的表达到下游制造全程质量控制中。与所有治疗药物一样，基因疗法，需要表征包装药物的递送载体电荷等。使用全柱成像毛细管等电聚焦电泳法（icIEF）来表征AAV的电荷异质性，可以确保产品的稳定性和一致性。Maurice兼具CE-SDS和iCIEF双功能。