茶饮料中咖啡因检测方案(二手分析仪器)

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分析与检测 FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES 超高效液相色谱法(UPLC)快速测定茶饮料中的咖啡因 王峰 (西安产品质量监督检验院，陕西西安，710068) 摘 要 建立了超高效液相色谱法(UPLC)测定茶饮料中咖啡因的含量。采用 CAPCELL PAK MGⅡ-C8色谱柱，UPLC方法进行测定。流动相为V(乙腈)：V(水)=10：90，流速为 0.5 mL/min，检测波长为273 nm，柱温为30℃。结果在0~120 pg/mL 内各组分峰面积与相应浓度呈良好的线性关系，R>0.999 47，加标回收率在89%~100%之间，方法精密度相对标准偏差小于10%。 咖啡因(caffeine )化学名是1，3，7-三甲基黄嘌呤或3，7-二氢-1，3，7三甲基-1H-嘌呤-2，6-二酮。咖啡因是从茶叶、咖啡果中提炼出来的一种生物碱，适度地使用有祛除疲劳、兴奋神经的作用。但是，大剂量或长期使用对人体有强烈的兴奋作用，也会对人体造成损害，特别是它具有成瘾性，一旦停用会出现精神萎顿、浑身困乏疲软等各种戒断症状。茶饮料中都含有一定量的咖啡因，对于检测茶饮料中咖啡因含量的方法主要有 GB/T5009.139-2003的高效液相色谱法和《出口饮料中维生素C和咖啡因检验方法 SN/T 0744-1999》等方法。 超高效液相色谱(ultra performance liquid chro-matography， UPLC)是分离科学中的一个全新类别，是以1.7pm 的超细色谱柱填料为核心技术的新型色谱分离分析技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量，可以极大的提高分离效率和分析速度斤2-5]。本文采用超高效液相色谱的方法测定咖啡因，建立了采用超高效液相色谱法测定茶饮料中咖啡因的方法，试验表明该方法前处理简单，分离效能好，回收率高，可以快速、简便、准确检测茶饮料中的咖啡因，得到准确的检测结果。 仪器与方法 1.1 仪器与试剂 超高效液相色谱(AQUITY UPLC WATERS 沃特世中国有限公司)，超纯水制备制统(Milli-Q密理博中国有限公司)，超声波清洗器(AS2060B 昆山何创超声仪器有限公司)。 ( 第一作者：助理工程师。 ) ( 收稿日期：2011-04-03，改回日期：2011-10-13 ) 乙i、甲醇(色谱纯，美国)；咖啡因标准品(购于Sigma 公司)；实验用水均为超纯水。 市售绿茶、冰绿茶、冰红茶、茉莉蜜茶、茉莉清茶等5种茶饮料。 1.2 试验方法 1.2.1 绿茶茶饮料供试品溶液的处理 把绿茶茶饮料原液用纯水按体积比1：10稀释，经0.45 pm 滤膜过滤后，待测。 1.2.2 标准溶液的配制 准确称取咖啡因标准品，甲醇溶解，配制浓度400 pg/mL的标准品溶液。 1.2.3 色谱条件的确定 分别在前期工作的基础上选用 CAPCELL PAKMGⅡ-C1谱色谱柱，以不同的流速、流动相配比和柱温作为参考因素，形成5个实验组，采用同一个绿茶饮料进样，进行色谱条件优化，最终确定测定咖啡因的最佳色谱条件。 表1 色谱条件的优化选择 实验组 流动相配比(体积比) 流速/(mL·min) 柱温/℃ 1 20%乙腈-80%水 0.3 40 2 18%乙腈-82%水 0.3 40 3 10%乙晴-90%水 0.5 40 4 10%乙腈-90%水 0.5 30 5 12%乙腈-88%水 0.3 40 1.2.4 咖啡因标准曲线的建立 精密吸取400 pg/mL的标准储备液，用纯水逐级及释为120、80、40、20和10 pg/mL 的标准系列溶液，以 0. 45 pm 有机相滤膜过滤。按最佳色谱条件进样1pL，以峰面积A 为纵坐标，标准品咖啡因的浓度为横坐标绘制标准曲线。 1.2.5 加标回收试验 为检验本方法的准确度，添加低、中、高3个浓度 的标准溶液于已知含量的绿茶茶饮料供供品溶液中，每个浓度分别做3组加标回收试验，分别计算平均回收率。准确量取一定量的绿茶茶饮料供试品溶液3份，添加一定体积的20.00、100.00和200.00 pg/mL的咖啡因标准溶液，摇匀，按1.2.3确定的最佳色谱条件测定，计算加标回收率。 1.2.6 精密度试验 为评价本方法检测结果的重现性，分别取同一份咖啡因标准准溶液50 pg/mL，在1d内重复进样测定5次，连续进样5d，以每次测得的峰面积在标准曲线上得到相应的含量，任取1d的结果，得到相应的日内精密度，用 RSD 日内表示，再取3d的测定结果，得到日间精密度，用RSD 日间表示。 1.2.7 茶饮料供试品中咖啡因的测定 取绿茶、冰绿茶、冰红茶、茉莉蜜茶、茉莉清茶等5个品种的市售茶饮料供试品溶液，分别进样1pL，用所建立的色谱分析方法测定，根据各组分的保留时间定性，峰面积和标准曲线定量。 2 结果与分析 2.1 检测波长的选择 为提高分析方法的灵敏度，应选择最佳吸收波长，取一定量咖啡因标准液进样测定，利用二极管阵列检测器的全波长进行紫外检测功能扫描，得到咖啡因的最大吸收波长为273 nm。 2.2 色谱条件的选择 选用合适的流动相及配比浓度，能够调节流动相的极性和洗脱能力，国标 GB/T 5009·139-2003的高效液相色谱法选用乙乙、水、甲醇作流动相，对只配置二元泵的液相色谱仪，需先混合，且乙腈毒性较大。按照表1的5个实验组的实验方案对色谱条件进行优化，结果见图1，分别由“1”、“2”、“3”、“4”、“5”表示5个实验组的色谱图。 按照表1所示的5种色谱条件分别进行试验，得到5组色谱图，如图1所示。结果表明，实验组4的色谱峰能够很好地将咖啡因组分与其他杂质组分分开，并且没有拖尾，显示出最好的分离效果，能使绿茶饮料中的干扰物质有效分离。咖啡因的保留时间为5.180 min，色谱条件为检测波长是273 nm，流动相是乙腈-水(10：90)，流速为 0.5 mL/min，柱温30℃，将此确定为最佳色谱条件。 2.3 标准曲线的线性范围 吸取一系列咖啡因标准液，在上述测定条件下， 图1 不同流动相的色谱分离图 注：5个实验组色谱条件分别为“1”是20%乙，80%水，0.3mL/min，40℃；“2”是是 18%乙腈，82%水，0.3 mL/min，40℃；“3”是10%乙乙，90%水，0.5 mL/min，40℃；“4”是 10%乙腈，90%水，0.5 mL/min，30℃，条件最好；"5”是12%乙腈，88%水，0.3 mL/min，40℃。 重复进样3次，以标准品品度(X)对其峰面积(Y)进行线性回归，得到回归方程、相关系数及线性范围。在0~120 pg/mL内，咖啡因的浓度与色谱峰面积的线性关系良好，其线性回归方程为：Y=6.51E+003x-9.22E+003，回归系数：R=0.999 47，标准曲线见图2. 图2 咖啡因标准曲线 2.4 加标回收试验 为检验本方法的准确度，精密量取已经测知含量的3份咖啡因样品5mL，分别加分20.0、100.00和200.00 ug/mL的咖啡因标准品溶液，进行加标回收率测定，结果见表2。 由表2可见，各添加标准溶液20.00、100.00和200.00 pg/mL，回收率分别为89.2%、94.5%和99.5%，回收率为89%~100%，较为理想。 2.5 精密度试验 由表3和表4可见，日内和日间的相对标准偏差均小于10%，符合实验要求。 2.6 样品测定 按上述供试样品溶液的制备方法，进样1pL，按上述色谱分析条件进行测定，结论得到5个品种的市 组分 样品本底值/ 低浓度 中浓度(ug/mL) 高浓度(pg/mL) 加人量/ 加标测定值/1 回收率/ 加人量/ 加标测定值/回收率/ 加人量/ 加标测定值/回收率/ (ug.mL) (ugmL)(ug.mL-) % (ugmL)(pgmL) % (pgmL)(pgmL") % 咖啡因 105.3 50 149.9 89.2 100 199.8 94.5 200 304.3 99.5 表3 日内精密度测定结果(n=5) 被测组分 测得值/ 平均测定值/ 标准偏差/ 精密度/ (pg'mL-)(pgml-)(ugmL-) % 108.2 109.2 咖啡因 108.3 108.9 0.688 0.63 109.3 109.8 表4日日间精密度测测结果(n=5) 被测组分 测得值/ 平均测定值/标准偏差/ 精密度/ (ugmL-) (pgmL-)(agmL-) % 108.2 109.3 咖啡因 109.2 109.2 0.576 0.52 109.6 109.6 表5 市售茶饮料咖啡因的测定 饮料名称 绿茶 冰绿茶 冰红茶 茉莉清茶 茉莉蜜茶 咖啡因含量/ (pgml-) 109.2 89 55 110 110 3 讨论 本方法选用 273 nm的紫外检测波长，V(乙乙)：V(水)=10：90 为流动相，流速为0.5 mL/min，柱温为30℃，对超高效液相色谱法测定咖啡因含量进行了研究与探讨。本方法适合于样品中咖啡因的测定，样品前处理简单，于扰物质分离效果好，峰形不拖尾，峰形 较好，分离效果理想。通过精密度试验，回收率实验和样品测定，验证了该方法的可行性。本方法具有灵敏度高、稳定、结果准确可行的特点。 ( 参考文献 ) ( [ 1 ] 陈椽、茶药学[M].北京：中国展望出版社， 1989：117 -119. ) ( [ 2 ] 刁飞燕，凤鸣，王秋丽，等，高效液相色谱法测定普 洱茶中茶氨酸、EGCG及咖啡因[J].卫生研究，2010， 39(1)：107-109. ) ( [ 3] 凌云，赵云峰，李志军，等.茶叶及茶饮料中儿茶素和咖 啡因的多组分 HPLC 分析方法[J] . 卫生研究，2005，34 (2)：187-189. ) ( [4 ] 陈小强，叶阳，成浩，等.三类茶中茶氨酸、咖啡碱及多 酚类的比较分析[J].食品研究与开发，2007，28(12)： 141-144. ) ( [ 5] 李志达，王壁瑜，陈振荣.食品、饮料中咖啡因的检测及定量分析[J].福州大学学报：自然科学版，1994，22 (6)： 1 16-120. ) ( [6 ] 帅琴，龚宇，杨薇，等.反相高效液相色谱法测定可乐、 茶叶中的咖啡因[J].分析试验室，2002，21(1)：68- 70. ) ( [ 7] 寇德运，可乐饮料中咖啡因测定研究[J].现代商贸工 业，2009(19)：314-315. ) ( [8 ] 徐明敏，陈波，杨毅华.紫外液相色谱法测定可乐中咖 啡因[J]. 中 国卫生检验杂志，2008，18(11)：2 399 - 2 400. ) Determination of Caffeine in Tea-drink by Ultra PerformanceLiquid Chromatography(UPLC) Wang Feng ( Xi'an Supervision and Inspection Institute of Product Quality，Shaanxi，Xi'an 710068，China) ABSTRACT To establish an UPLC method for the determination of caffeine in tea drinks. Methods ：The UPLC sys-tem consisted of CAPCELL PAK MG Ⅱ -C18 column， acetonitrile- water (10：90) as a mobile phase， with a detectionwavelength at 273 nm. The flow rate was 0.5mL/min and column temperature was 30℃. Results ： The linear rangewas between 0 and 120 ug/mL， R>0. 999 47. The average recovery was between 89% and 100%. The RSD wasless than 10%. Conclusion： The method is simple， accurate， and reliable and can be used in the detection of teadrink. Key words ultra performance liquid， caffeine， precision， liner detection range 第第(总第) Vol.No. (Total 建立了超高效液相色谱法（UPLC）测定茶饮料中咖啡因的含量。采用 CAPCELL PAK MG Ⅱ-C18色谱柱，UPLC方法进行测定。流动相为V（乙腈）：V（水）=0:90，流速为0.5mL/moin，检测波长为273nm，柱温为30℃。结果，在0~120μg/mL内各组分峰3面积与相应浓度呈现良好的线性关系，R＞0.9947，加标回收率在89%~100之间，方法精密度相对标准偏差小于10%。