胆汁酸中定量分析检测方案(气质联用仪)

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LAAN-A-MS066 ApplicationNo.M283News岛津SHIMADZUhttp：//www.shimadzu.com.cn用户服务热线电话： 800-810-0439第一版发行日：2019年8月400-650-0439 GC/MS 通过 GC-MS 进行胆汁酸分析 随着肠道菌群研究的兴起，对肠道菌群产生成分的分析引起了人们的关注，而这些成分之一就是胆汁酸。 胆汁酸是具有胆酸骨架化合物的通称，是一种类固醇衍生物，通常使用LC-MS/MS 对其进行分析。但是，许多化合物的分子结构相似，为了实现更好的分离，在很多情况下也使用GC-MS。利用 GC-MS分析胆汁酸时，必须对亲水性侧链(例如羧基和羟基)进行衍生化，以确保挥发性。 本文介绍了通过对羧基进行甲基化以及对羟基进行三甲基硅烷(TMS)化，来对胆汁酸进行定量分析的示例。在该示例中，22种胆汁酸化合物的线性范围在100倍以上以及线性相关系数R²> 0.995. T. Sakai |胆汁酸的结构和衍生化 胆汁酸化合物的分子量较大，并且官能团具有亲水性，因此挥发性较差，在这种状态下无法直接进行 GC-MS分析。为了开展GC-MS分析，必须将亲水性官能团衍生化。胆汁酸中重要的官能团是羟基和羧基，至少需将它们进行衍生化，从而置换成其他基团。 图1胆汁酸化合物之一 Cholic acid 的结构分子内存在3个羟基和1个羧基 图2衍生化示意图 羟基的三甲基硅烷化，羧基的甲基化 三甲基硅烷化通常可以对羟基和羧基的亲水性基团进行衍生化，但形成的胆汁酸衍生化合物不稳定，因此本文采用了将羧基甲基化后，将羟基三甲基硅烷化的衍生化方法。预处理的详情如图3所示。 图3胆汁酸的衍生化方案 衍生化胆汁酸的测定 通过 GC-MS 对上述衍生化胆汁酸进行分析。分析条件如下所示。 表1测定条件 GC-MS GCMS-QPTM2020 NX 色谱柱 DB-5MS (30 m x 0.25 mm， 0.25 um) -GC- 进样模式 不分流 气化室温度 310℃ 柱温箱温度 230℃(2min)→(8℃/min)→310℃ (5 min) 控制模式 线速度(45.3cm/sec) 吹扫气流量 3.0 mL/min -MS- 测定模式 scan 或 SIM (扫描范围：m/z 35-700) 离子源温度 200℃ 接口温度 280℃ 事件时间 0.3 sec 定量准确性确认 对22种胆汁酸标准品，各取8pg实施上述预处理，并以scan 模式进行 GC-MS分析。图4显示了胆酸的峰。 在确认了各胆汁酸的保留时间和质谱图后，对22种胆汁酸标准品混合溶液(0.1、0.5、1.0、5.0、10、50、100、500ng)进行与上述相同的预处理，并进行SIM分析，将胆酸-d5作为内标，采用内标法制定了标准曲线。图5为标准曲线。表2为每种胆汁酸的线性范围和线性相关系数。对于检测到多个峰的化合物，每个峰均用括号中的数字加以区分。表2还显示了线性范围内最小浓度下重复进样3次时的重现性。 样品稳定性验证 对22种胆汁酸标准准，各取 8ug 进行上述预处理， 并在首次分析20小时后再次进行分析。当时峰的相对强度(与首次分析时的峰强度之比)列在表2中的“20小时后峰面积的相对值”一列中。所有胆汁酸峰的重现性良好，为70%-120%。另外，在38小时后也进行了同样的分析，结果有几种胆汁酸的峰面积呈减少趋势，但对于其他多种胆汁酸，均可以进行稳定的测量。 (x1，000，000) 368.00 5.00458.00 343.20 4.0 3.0. 2.0寸 1.0= 15.5 16.0图48ug Cholic acid 的质谱图 图5 Cholic acid 的标准曲线 表222种胆汁酸的测定结果 胆汁酸名 CAS No. 定量离子 m/z 定性离子 m/z 线性范围(ng) 线性(R²) n=3的重现性(%RSD) 20小时后的 38 小时后的 峰面积相对值峰面积相对值 Cholic acid 81-25-4 368.0 458.0 0.1-100 0.999 6.65 0.984 1.011 Chenodeoxycholic acid 474-25-9 370.0 355.0 0.5-100 0.999 4.71 0.949 0.920 Ursodeoxycholic acid 128-13-2 460.0 370.0 0.5-500 0.999 2.24 1.206 0.924 eoxycholic acid 302-95-4 255.0 370.0 0.5-100 0.999 6.11 0.980 0.714 Lithocholic acid 434-13-9 372.0 357.0 1-500 0.999 7.66 0.991 0.750 Hyocholic acid 547-75-1 458.0 369.0 0.1-100 0.999 5.51 1.036 1.035 3-oxocholic acid (1) 2304-89-4 546.0 341.0 1-500 0.999 7.95 0.848 0.575 3-oxocholic acid (2) 2304-89-4 269.0 384.0 0.5-500 0.999 2.36 0.914 0.714 7-oxodeoxycholic acid 911-40-0 341.0 359.0 1-500 0.999 5.51 1.029 1.053 7-oxolithocholic acid 4651-67-6 293.2 353.25 5-500 0.998 8.89 0.817 0.920 Ursocholic acid 2955-27-3 253.0 343.0 0.5-100 0.999 5.52 1.019 0.840 3-oxodeoxycholic acid (1) 4185-01-7 548.0 343.0 5-500 0.999 4.27 0.959 0.645 3-oxodeoxycholic acid (2) 4185-01-7 548.0 343.0 10-500 0.999 12.39 0.930 0.633 3-oxodeoxycholic acid (3) 4185-01-7 271.0 253.0 5-500 0.999 8.20 1.043 0.867 3-oxolithocholic acid (1) 1553-56-6 460.0 431.0 5-500 0.999 5.43 0.959 0.924 3-oxolithocholic acid (2) 1553-56-6 460.0 431.0 10-500 0.997 7.97 0.720 0.481 3-oxolithocholic acid (3) 1553-56-6 273.0 318.0 5-500 0.999 3.08 0.885 0.809 Hyodeoxycholic acid 83-49-8 370.0 255.0 0.5-500 0.999 6.44 1.139 0.860 3f3-hydroxy-5-cholenoic acid 5255-17-4 331.0 370.0 5-500 0.999 3.95 0.993 0.927 a-muricholic acid 2393-58-0 458.0 443.0 5-500 0.999 5.09 1.027 0.834 f3-muricholic acid 2393-59-1 285.0 458.0 0.5-500 0.998 7.21 0.866 1.033 w-muricholic acid 6830-03-1 285.0 369.0 0.5-500 0.999 4.49 0.842 0.882 Phoenodeoxycholic acid 566-17-6 255.0 370.0 0.5-500 0.999 5.48 0.977 0.962 Isolithocholic acid 1534-35-6 372.0 215.0 1-500 0.999 2.38 1.051 0.920 Alloisolthocholic acid 2276-93-9 372.0 447.0 5-500 0.999 4.35 1.080 1.033 12-oxolithocholic acid 5130-29-0 476.0 386.0 5-500 0.998 8.51 0.769 0.937 isodeoxycholic acid 570-63-8 255.0 345.0 0.5-500 0.999 0.68 0.952 0.623 岛津应用云 ( 本文档中描述的产品尚未根据《药品和医疗器械法》被批准为医疗器械。无法用于治疗诊断目的，无法通过正常程序使用。 ) GCMS-QP是岛津制作所株式会社在日本及其他国家的商标。 L5 ( 岛津企业管理(中国)有限公司岛津(香港)有限公司 ) ( *本资料未经许可不得擅自修改、转载、销售； ) ( *本资料中的所有信息仅供参考，不予任何保证。 ) ( 如有变动，恕不另行通知。 ) 随着肠道菌群研究的兴起，对肠道菌群产生成分的分析引起了人们的关注，而这些成分之一就是胆汁酸。胆汁酸是具有胆酸骨架化合物的通称，是一种类固醇衍生物，通常使用LC-MS/MS对其进行分析。但是，许多化合物的分子结构相似，为了实现更好的分离，在很多情况下也使用GC-MS。利用GC-MS分析胆汁酸时，必须对亲水性侧链（例如羧基和羟基）进行衍生化，以确保挥发性。本文介绍了通过对羧基进行甲基化以及对羟基进行三甲基硅烷（TMS）化，来对胆汁酸进行定量分析的示例。在该示例中， 22种胆汁酸化合物的线性范围在100倍以上以及线性相关系数R2＞0.995。