抗生素中分离纯化检测方案(制备液相色谱)

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C18AQ柱应用于大极性抗生素类杂质的制备纯化作者：应用技术研究中心 关于SepaFlash@ C18AQ反相分离柱系列产品 应用文章 AN019 i背景介绍 抗生素 ( antibiotics)是由微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)所产生的具有抑制其它类微生物生长、生存的一类次级代谢产物，以及用化学方法合成或半合成的类似化合物。人类发现的第一种抗生素-一青霉素(盘尼西林)，是英国微生物学家亚历山大·弗莱明 (Alexander Fleming)于1928年偶然发现的，他从被霉菌污染的葡萄球菌培养皿中，观察到霉菌附近的细菌都无法生长，推测霉菌中可能有杀菌的物质，但当时并没有提纯出有效成分和分析化学结构，到了1939年牛津大学的佛洛(Howard florey)和柴恩(Ernst Chain) 想开发能治疗细菌感染的药物，在联终弗莱明取得菌株后，成功提纯出青霉素，弗莱明，佛洛与柴恩因此干1945年同获得诺贝尔牛理学和医学奖，抗生素最主要的用途是作为抗菌剂用干医疗方面，可以用来杀死细菌，作为抗菌剂使用的抗牛素有以下几个主要类别；3-内酷胺类抗牛素(包括青霉素，头孢菌素等)，氰基糖苷类抗牛素，大环内脂类抗牛素，四环素类抗牛素以及零素(全合成抗生素)等，抗生素的来源主要包括牛物发酵半合成以及全合成，其中，牛物发酵抗生素由干化学稳定性毒副作用抗菌谱等问题，需要采用化学方法对其进行结构改请，从而增加其稳定性，降低毒副作用，扩大抗菌谱，减少耐药性，改善生物利用度讲而提高药物治疗的效果，因此，半合成抗生素是目前抗生素药物研发领域最为热门的方向。 在半合成抗生素药物的研发过程中，由于抗生素来源于微生物发酵产物，存在着纯度低、副产物多、组分复杂等特点，因此半合成抗生素药物的杂质分析和控制就显得尤为关键。为了对杂质进行有效的鉴定和表征，需要从半合成抗生素的合成产物中获得足够量的杂质。在常用的杂质制备技术中，快速液相制备色谱技术(Flash Chromatography) 是一种经济高效的方法，具有制备量大、过程快速、成本低廉等优势，目前已受到广大研究人员的日益重视。 本文中以某半合成氨基糖苷类抗生素药物的主要杂质为样品，利用SepaFlash@C18AQ柱并结合SepaBean@Imachine对其进行了制备纯化，获得了满足需求的目标产物，为此类样品的分离纯化提供了便捷高效的解决方案。 i实验部分 本文中待纯化的样品来自某制药公司，为氨基多环糖类物质，结构类似于氨基糖苷类抗生素，其极性很大，易溶于水，其分子结构式示意图参见图1，粗品纯度约为88%(HPLC分析结果)。对于此类大极性化合物的分离纯化，根据我们之前的制备纯化经验，样品分子在普通C18分离柱上的保留很弱，因此，考虑采用C18AQ柱对其进行分离纯化。 【图1.氨基糖苷类抗生素杂质样品结构式示意图】 取400 mg白粉粉末状粗品固体，溶于5mL纯水中，超声使样品完全溶解为澄清透明溶液。利用注射器将样品溶液上样至Flash分离柱上，样品的Flash分离纯化实验参数如表1所示。 【表1.Flash制备纯化实验参数设置】 仪器 SepaBeanmachine 2 色谱柱 12g SepaFlashC18AQ反相分离柱(球形硅胶，20-45 um， 100 A， 订货号：SW-5222-012-SP(AQ)) 检测波长 204 nm，220nm 溶剂A：水； 流动相 溶剂B：乙洁 流速 15mL/min 进样量 400mg 洗脱梯度 时间 (min) 溶剂B (96) 0 0 19.0 8 47.0 80 52.0 80 样品在C18AQ柱上的Flash制备图谱如图2所示。分析图2可知，氨基糖苷类抗生素杂质样品在C18AQ柱上获得了有效地保留，且粗品中的其他杂质也得到了有效的分离。将收集组分进行冻干处理后，经HPLC分析(采用C18AQ分析柱)，所得纯化产物的度约为96.2%(参见图3)，可以用于下一步的研究开发。 【图2.样品在C18AQ分离柱上的Flash纯化色谱图】 【图3.目标产物的HPLC分析图谱】 因此，对于大极性半合成抗生素类杂质的制备纯化， SepaFlash@ C18AQ反相分离柱配合SepaBean@machine快速液相制备色谱系统，为此类样品的快速分离纯化提供了快捷高效的解决方案。 三泰科技推出的SepaFlash@C18AQ反相分离柱系列产品具有多种规格(参见表2)。 【表2. SepaFlash@ C18AQ反相分离柱参数】(填料：High-efficiency spherical C8(AQ)，20-45um，100A) Item Number Column Size Flow Rate Max Pressure (mL/min) (psi/bar) SW-5222-004-SP(AQ) 5.4g 5-15 400/27.5 SW-5222-012-SP(AQ) 20g 10-25 400/27.5 SW-5222-025-SP(AQ) 33g 10-25 400/27.5 SW-5222-040-SP(AQ) 48 g 15-30 400/27.5 SW-5222-080-SP(AQ) 105g 25-50 350/24.0 SW-5222-120-SP(AQ) 155g 30-60 300/20.7 SW-5222-220-SP(AQ) 300g 40-80 300/20.7 SW-5222-330-SP(AQ) 420g 40-80 250/17.2 如需进一步了解SepaBean@rmachine的详细规格信息，或配套使用的Flash纯化柱订购信息，请访问CBG在线商店 https：//store.chembeango.cn ( 址 地 ：江苏省常州市 新 北区庆阳路78号 ) ( 机：0519-85150175 ) ( 销售部：400-625-6069 ) ( 真：0 5 19-85153561 ) ( 传 网 址：w w w.santaitech.com ) ( 产品订购信箱： order@santaitech.com ) ( 销售部信箱： sale s @santaitech.com技术支持信箱： su p port@santaitech.com ) ( 客户服务信箱： service@santaitech.com ) 应用技术研究中心信箱： SAT@santaitech.com/ 本文中待纯化的样品来自某制药公司，为氨基多环糖类物质，结构类似于氨基糖苷类抗生素，其极性很大，易溶于水，其分子结构式示意图参见图1，粗品纯度约为88%（HPLC分析结果）。对于此类大极性化合物的分离纯化，根据我们之前的制备纯化经验，样品分子在普通C18分离柱上的保留很弱，因此，考虑采用C18AQ柱对其进行分离纯化。图1. 氨基糖苷类抗生素杂质样品结构式示意图。取400 mg白色粉末状粗品固体，溶于5 mL纯水中，超声使样品完全溶解为澄清透明溶液。利用注射器将样品溶液上样至Flash分离柱上，样品的Flash分离纯化实验参数如表1所示。表1. Flash制备纯化实验参数设置仪器SepaBean® machine 2色谱柱12 g SepaFlash® C18AQ反相分离柱(球形硅胶, 20 - 45 μm, 100 Å, 订货号：SW-5222-012-SP(AQ))检测波长204 nm, 220 nm流动相溶剂A：水；溶剂B：乙腈流速 15 mL/min进样量400 mg洗脱梯度时间 (min)溶剂B (%)0019.0847.08052.080结果与讨论样品在C18AQ柱上的Flash制备图谱如图2所示。分析图2可知，氨基糖苷类抗生素杂质样品在C18AQ柱上获得了有效地保留，且粗品中的其他杂质也得到了有效的分离。将收集组分进行冻干处理后，经HPLC分析（采用C18AQ分析柱），所得纯化产物的纯度约为96.2%（参见图3），可以用于下一步的研究开发。图2. 样品在C18AQ分离柱上的Flash纯化色谱图。图3. 目标产物的HPLC分析图谱。因此，对于大极性半合成抗生素类杂质的制备纯化，SepaFlash C18AQ反相分离柱配合SepaBean machine快速液相制备色谱系统，为此类样品的快速分离纯化提供了快捷高效的解决方案。关于SepaFlash C18AQ反相分离柱系列产品三泰科技推出的SepaFlash C18AQ反相分离柱系列产品具有多种规格（参见表2）。表2. SepaFlash C18AQ反相分离柱参数（填料:High-efficiency spherical C8(AQ), 20 – 45 μm, 100 Å）Item NumberColumn SizeFlow Rate(mL/min)Max.Pressure(psi/bar)SW-5222-004-SP(AQ)5.4 g5-15400/27.5SW-5222-012-SP(AQ)20 g10-25400/27.5SW-5222-025-SP(AQ)33 g10-25400/27.5SW-5222-040-SP(AQ)48 g15-30400/27.5SW-5222-080-SP(AQ)105 g25-50350/24.0SW-5222-120-SP(AQ)155 g30-60300/20.7SW-5222-220-SP(AQ)300 g40-80300/20.7SW-5222-330-SP(AQ)420 g40-80250/17.2