母牛原乳中乳腺炎病原体的 qPCR检测方案(PCR)

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analytikjenaAn Endress+Hauser Company 母牛原乳中乳腺炎病原体的 qPCR 检测 支原体尤其是牛支原体，以及金黄色葡萄球菌和无乳链球菌是母牛和犊牛中常见的有害病原体，可引起炎症和乳腺炎。牛患乳腺炎将导致牛奶数量的减少，除了影响动物健康外，还将对经济产业产生重大影响。在兽医诊断中，从牛奶中有效分离出有害病原体并快速准确地检测出来显得尤为重要。由于牛支原体没有细胞壁，因此对抗生素治疗具有天然抗性，治疗特别困难，只有隔离有病症的母牛才能阻止其传播。 由于牛奶的成分比较复杂，如含有大量的蛋白、脂肪和糖类，从牛奶中提取病原体DNA 是一项比较大的挑战。因此，我们建议采用专门的提取试剂盒或程序，例如DNA Diagnostic 公司的 Mastit 4C 提取试剂盒，该试剂盒专门针对从牛奶中提取病原体 DNA 进行了优化，，以提供高效稳定的提取效果。从牛奶中提取获得的 DNA 配合 DNA Diagnostic 公司的 Mastit 4C 检测试剂盒，在qTOWER3荧光定量 PCR 仪上进行检测。检测试剂盒 Mastit 4C 可同时检测四个靶标基因，如金黄色葡萄球菌，无乳链球菌，牛支原体和支原体，并提供扩增内质控 IAC。 本应用方案介绍了在 qTOWER3上配合 Mastit 4C 检测试剂盒，进行多种病原体检测的方法，并证明了其特异性。 采用 DNA Diagnostic 公司的 Mastit 4C 提取试剂盒从牛奶中分离纯化出病原体 DNA。样品为500ml生乳，目的是检测样品中是否含有葡萄球菌、链球菌、牛支原体和支原体。加上扩增内质控，整个反应是一个五重的检测(FAM检测牛支原体， HEX 检测金黄色葡萄球菌， ROX 检测无乳链球菌， Cy5 检测支 原体，， Quasar 705检测内质控 IAC) 表1： qPCR反应程序 Cycle Profile Temperature Holding time 1 40 Initial denaturation 95°C 1 min Denaturation 95℃ 10 sec Annealing/ Elongation* 60℃ 25 sec 检测结果： 内质控 IAC 有效性的评估标准是 Ct 值小于32，所有检测样品 IAC 的 Ct值在23到31之间，这表明 qTOWER和 Mastit 4C 检测试剂盒的扩增可以完美地协同工作。再结合NTC (无模板对照)和阳性对照的结果，可以确认整个实验结果是有效的。 待测样品中，2号和3号样品显示 IAC 阳性，但其他所有通道结果均为阴性，可判定这两个样品未感染所检测的这几种病原体。 1号和4号样品显示 ROX 通道为阳性信号，可判定为无乳链球菌感染。样品5显示HEX(金黄色葡萄球菌)， ROX(无乳链球菌)和Cy5(支原体)都有明显的Ct值，可判定为这几种病原体检测均为阳性。 表2：基于Mastit 4C检测试剂盒和 qTOWER3的qPCR检测结果 Sample Target IAC Mycoplasma bovis Staphylococcus aureus Streptococcus agalactiae Mycoplasma species Quasar 705 FAM HEX ROX Cy5 Sample 1 29.29 no Ct no Ct 21.13 no Ct Sample 2 30.18 no Ct no Ct no Ct no Ct Sample 3 31.59 no Ct no Ct no Ct no Ct Sample 4 29.59 no Ct no Ct 35.7 no Ct Sample 5 24.87 no Ct 14.79 10.65 18.33 Positiv control 23.47 19.15 19.67 14.14 18.19 NTC 28.44 no Ct no Ct no Ct no Ct 采用DNA Diagnostic公司的Mastit 4C提取试剂盒从牛奶中分离纯化出病原体DNA。样品为500 µl生乳，目的是检测样品中是否含有葡萄球菌、链球菌、牛支原体和支原体。加上扩增内质控，整个反应是一个五重的检测（FAM检测牛支原体，HEX检测金黄色葡萄球菌，ROX检测无乳链球菌，Cy5检测支原体，Quasar 705检测内质控IAC）