豆芽中6-苄基腺嘌呤检测方案(液相色谱仪)

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TShCerImEoNFTiIsFheIrC RLC-SH-120115快速溶剂萃取-在线固相萃取-高效液相色谱测定豆芽中的6-苄基腺嘌呤 检测项目 6-苄基腺嘌呤 仪器型号 ASE350 UltiMate3000： DGP-3600WPS-3000TSL TCC-3000 DAD-3000 参考方法 GB/T23381-2009 实验员 车金水 最终审核 叶明立 6-苄基腺嘌呤(6-benzylaminopurine， 6-BA)是一种人工合成的细胞分裂素，与植物内源激素具有相似的结构和性质，能够抑制植物叶内叶绿素、核酸和蛋白质分解，广泛用作无根豆芽的生长调节剂。人体摄入过多6-BA会刺激皮肤黏膜，造成食道、胃黏膜损伤，出现恶心、呕吐等现象。我国规定了豆芽中6-BA的最高允许使用量(0.01 g/kg) 和最高允许残留量(0.20mg/kg)。由于利益的驱使，近年来曝光了多起“毒豆芽”事件，不法商家在生产豆芽时添加大量的添加剂。 目前，国内均采用 《GB/T23381-2009》的方法对豆芽及其他蔬菜中的6-苄基腺嘌呤进行检测，但需采用离线 SPE 净化去除杂质干扰，然后进行液相色谱分析。该方法前处理较为复杂，需要提取和净化以后方能进行 HPLC-UV 测定。本实验主要依据《GB/T23381-2009》方法，样品用快速溶剂萃取提取后，采用双三元液相色谱系统进行在线净化后直接进行分析，相比于原始的国标方法，在线方法不仅简化了样品前处理过程，同时提高了检测限和样品测定的重现性。 图16-苄基腺嘌呤分子结构 1、、材料与方法 6-苄基腺嘌呤标准品 (HPLC 级)购自上海晶纯试剂有限公司。精确称取标准品样品，用甲醇稀释至100pg/mL 的标准溶液，逐级稀释至0.05、0.10、0.50、1.00和10.0 ug/mL，待 HPLC 分析。 2、、 AHSE 萃取 采用粉碎机将豆芽样品粉碎。精确称取10g样品，和硅藻土混合后，倒入事先垫有纤维素膜的萃取池 (SST， 22mL)中，按下列 ASE 条件萃取(表1)。萃取液定容至25mL， 过0.45um滤膜，待HPLC分析。 表1ASE 萃取条件 条件 参数 萃取溶剂 甲醇 萃取温度 40℃ 静态时间(min) 5 静态循环次数 2 吹扫体积 60% 吹扫时间 120s 总溶液消耗(ml) 总时间(min) 3、 色谱条件 分析柱 Acclaim C18， 120A， 4.6*150mm*5um 净化柱 Agilent SCX， 4.6*10mm*5um 柱温 30°C 流速 净化泵和分析分： 1ml/min 进样量 10uL 检测波长 UV@267nm 分析泵流动相 A： 20mM 乙酸铵， pH 4.5 B：甲醇 分析泵条件 时间 (min) 分析泵 (A%) 分析泵 (B%) 0 70 30 7 70 10 26 40 60 31 40 60 31.1 70 30 净化泵流动相 A：水 B：甲醇 C： 500mM醋酸铵， pH 4.5 净化泵梯度 图3标准样品样谱图 (0.5ppm) 4、结果与讨论 4.1 ASE 萃取讨论 本实验参照《GB/T23381-2009》方法，采用甲醇作为快速溶剂萃取的萃取溶剂。同时考察不同萃取温度(40℃、60℃、80℃和100℃)对豆芽中6-苄基腺嘌呤的提取率的影响。实验采取空白样品加标的方式进行，实验结果表明，随着提取温度的升高，对豆芽中的提取率明显下降，可能与6-苄基腺嘌呤的热稳定性有关。故本实验采用40℃作为本实验的萃取温度。 为研究静态萃取时间及循环次数对6-苄基腺嘌呤萃取效率的影响，本方法采用固定静态萃取时间(5min)的方法，考察不同循环次数中对6-苄基腺嘌呤的萃取量。实验结果表明，第一次萃取循环对6-苄基腺嘌呤的提取效率约为90%，第二次萃取循环对6-苄基腺嘌呤提取效率约为10%，第三次萃取循环对6-苄基腺嘌呤的提取效率不到1%。故本实验采用 两次萃取循环。 采用快速溶剂萃取法萃取豆芽中的6-苄基腺嘌呤，较国标《GB/T23381-2009》中超声提取时间消耗更短、溶剂用量少、效率高、操作步骤更简单等优点。 4.2固相萃取柱选择 在线固相萃取-高效液相色谱联用方法，净化柱是实验成败的关键。《GB/T23381-2009》中采用 C18 SPE 小柱作为离线 SPE 小柱。由于6-苄基腺呤具有2个叔氨基，具有较强的离子交换能力，可以使用阳离子交换小柱进行净化。本实验比较了 C18， PAII， SCX (Agilent公司)三种不同净化小柱对净化效果的影响。采用采用同一加味样品，分别用三种小柱进行净化实验。其中 C18， PAII 采用 20%的甲醇/水作为洗脱溶剂， SCX 采用 5/95 的甲醇/500mM乙酸铵作为洗脱溶剂。实验结果见图2，三种净化小柱均能对豆芽中的6-苄基腺嘌呤进行净化处理，但采用 C18和PAII小柱时，色谱图中杂质峰较多，而采用 SCX 小柱时，色谱图中杂质峰几乎没有。所以本实验采用 SCX 小柱作为固相萃取柱。 18.3-mAy WVL：267nm 图2不同固相萃取柱色谱峰比较(1： C18；2： PAII； 3： SCX) 4.3方法线性范围、检测限和重现性 按优化后的色谱条件，分别测定了50，100，200，500， 1000ug/L工作溶液，以峰面积对浓度进行线性拟合，得出在50 -1000 ug/L范围内线性良好， 6-BA的线性方程为Y=0.0011X-0.0069，线性相关系数R²=0.9996， 检测限为 9.6 ug/Kg (S/N=3)。连续进样5次加标样品(100ug/L)， 得出6-BA峰面积，峰高和含量R.S.D. 均小于2.0%(表2)。 表2样品重复性实验数据 Sample No. Ret.Time Area Height Amount Plates min mAU*min mAU ug/L (EP) 1 24.943 0.1051 0.6062 98.5803 131608 2 24.967 0.1036 0.6162 97.2425 133499 3 24.980 0.1013 0.6408 95.2426 109929 4 24.977 0.1013 0.6277 95.2107 103576 5 24.990 0.1016 0.6151 95.4785 101088 Average： 24.971 0.1026 0.6212 96.3509 115940 Rel.Std.Dev： 0.071% 1.666% 1.923% 1.562 % 13.386% 4.4样品测定及加标回收率 将黄豆芽样品和绿豆芽样品按“第2节”中方法样品前处理，按“第3节”中色谱方法分析。并对绿豆芽样品做加标回收实验。黄豆芽和绿豆芽加标回收率如表3所示，样品加标50 ug/Kg时回收率在102.4%~107.3%，加标100 ug/Kg时回收率在95.2%~98.6%，加标1000ug/Kg 时回收率在 96.3%~96.2%。表明方法可准确用于实际样品中6-BA 的测定。绿豆芽及 加标样品测定色谱图如图3所所。 图3样品及样品加标色谱图 表3 样品在不同加标浓度时回收率测定结果 待测物加入量 样品本底值 加标回收率/% 50ug/Kg 100ug/Kg 1000ug/Kg 黄豆芽 ND 102.4 98.6 96.3 绿豆芽 ND 107.3 95.2 97.2 5、 总结 采用快速溶剂萃取-在线固相萃取-高效液相色谱测定方法可快速准确完成豆芽中6-苄基腺嘌呤的萃取、净化和测定。整个分析过程几乎无需人工参与，可以连续进行样品分析工作。与传统方法相比，本方法具有快速、试剂消耗量低、重现性高、简单方便等特点。 采用快速溶剂萃取-在线固相萃取-高效液相色谱测定方法可快速准确完成豆芽中 6-苄 基腺嘌呤的萃取、净化和测定。整个分析过程几乎无需人工参与，可以连续进行样品分析工 作。与传统方法相比，本方法具有快速、试剂消耗量低、重现性高、简单方便等特点。