唾液中亲水性代谢产物检测方案(液质联用仪)

智能文字提取功能测试中

Application No.C233News News 岛津SHIMADZU用户服务热线电话： 800-810-0439第一版发行行：2020年10月 LC/MS 三重四极杆质谱仪 LCMSTM-8060NX分析唾液中亲水性代谢产物的代谢组学研究 人口腔中大约生活着约700种、90亿个细菌，这些细菌和肠道细菌一样，能产生短链脂肪酸。现在逐渐查明，口腔细菌产生的短链脂肪酸对牙周组织具有危害作用。例如，牙周病的主要病原体口腔厌氧革兰氏阴性细菌会产生大量的短链脂肪酸(尤其是丁酸)。 近年来，代谢组学技术因其能全面分析体内代谢产物而成为研究热点。代谢组学分析是指全面分析经细胞活动产生的氨基酸和有机酸等小分子代谢产物，明确多个试样群中差异的学术领域，与其他组学相比，对象组分较少，因而易于进行全面分析。 本报告介绍了一个案例，使用超高效液相色谱质谱仪(LC/MS/MS) 进行唾液代谢组学分析。众所周知，唾液中含有口腔细菌产生的代谢产物，同时含有口腔细菌。因此，因口腔细菌的作用而在唾液中含有的代谢产物数量会受到分析之前的唾液保存状态的影响。因此，使用代谢组学分析调查了保存温度对唾液所含代谢产物的影响。 T. Hattori， Y. Yamada 样品 唾液采自一名健康成年男性。采集后按12000 rpm 进行10分钟离心分离，然后将其上清液分装到4个微型管中。各样品分别在-80、4、25、40℃下保存3天。 预处理 在短链脂肪酸/有机酸分析的预处理中，为了增加目标物在ODS色谱柱上的保留，并提高 MS检测的灵敏度，将样品用3-硝基苯肼(3-NPH)衍生化。在唾液中添加3-NPH(衍生化试剂)、吡啶(催化剂)、碳二亚胺(缩合剂)、2-乙基丁酸(内标物质)，室温下反应30分钟。反应后，使用含有甲酸的甲醇溶液稀释5倍。 在用于同时分析亲水性代谢产物的预处理当中，用超纯水对唾液稀释5倍。稀释时，添加了2-吗啉乙磺乙 (MES)，使得内标物质浓度为 1 umol/L。 分析条件 使用LC/MS/MS 短链脂肪酸方法包和 LCMS-8060NX进行短链脂肪酸/有机酸分析。本分析法可分析醋酸、丙酸、丁酸等6种短链脂肪酸以及有关中心代谢路径的16种有机酸。表1所示为 HPLC 及 MS分分析条件。 表1分析条件(短链脂肪酸、有机酸分析) [HPLC conditions] (NexeraTM X3) 色谱柱 ：反相柱 流动相 ：A) 0.1%甲酸水溶液 B)乙腈 模式 ：梯度洗脱 流速 ：0.35mL/min 进样量 ：3pL [MS条件](LCMS-8060NX) 离子源 ：ESI(正离子和负离子模式) 喷针位置 ：+3mm 模式 ：MRM 雾化气流量 ： 2.0L/min 干燥气流量 ：10.0L/min 加热气流量 ： 10.0L/min DL 温度 ：250℃ 加热模块温度 ：400℃ 接口温度 ： 300℃ 亲水性代谢产物的同时分析利用 LC/MS/MS 初级代谢产物方法包 ver.2中含有的液质采集方法，采用 LCMS-8060NX 进行。本分析方法可实现对生命科学领域代谢组学分析中已知重要的氨基酸、有机酸、核苷、核苷酸等97种亲水性代谢产物同时进行分析。表2所示为 HPLC 及 MS的分析条件。 表2分析条件(亲水性代谢产物同时分析) [HPLC 条件](Nexera X3) 色谱柱 ：反相柱 流动相 ：A)0.1%甲酸水溶液 B)0.1%甲酸乙腈溶夜 模式 ：梯度洗脱 流速 ：0.25mL/min 进样量 ： 3uL [MS条件](LCMS-8060NX) 离子源 ：ESI(正离子和负离子模式) 探针位置 ： +3mm 模式 ：MRM lonFocus 电压 ：±2kV 雾化气流量 ： 3.0L/min 干燥气流量 ： 10.0L/min 加热气流量 ： 10.0 L/min DL 温度 ：250C 加热模块温度 ：400℃ 接口温度 ： 300℃ 利用IonFocusTM 设备提高灵敏度 分析活体、食品等基质较多的样品时，通过离子源远离 MS导入部，可以降低基质的影响，但导入MS的离子会减少，造成灵敏度下降。LCMS-8060NX 的 lonFocus 设备(图1)通过聚焦电极输送离子，高效地仅将离子导入质谱仪，去除多余的中性粒子。因此，即使在离子源远离 MS 导入部的情况下，灵敏度也不会下降，兼顾分析灵敏度与仪器稳健性。针对从唾液中检测出的亲水性代谢产物，确认 lonFocus 设备的效果后发现，即使在离子源远离MS 导入部的情况下，灵敏度也不会下降，灵敏度平均提高约1.4倍。图2所示为灵敏度提高示例。 图2lonFocus 设备提高灵敏度 PeakintelligenceTM 波形处理 利用 LabSolutions InsightTM 的选配软件 Peakintelligence 对检测出的色谱峰进行峰形处理。 Peakintelligence 会使Al学习熟练操作者进行的峰形处理，实现与熟练者同等水平的解析。如图3所示，即使是附近有其他组分峰干扰的情况下， Peakintelligence也可以正确地进行检测和峰形处理。由此可降低误检测及未检测色谱峰，缩短确认和修改峰形处理结果所需的时间。 图3 Peakintelligence 峰形处理 代谢组学分析 短链脂肪酸、有机酸的分析结果显示，共有6种短链脂肪酸、14种有机酸被检出。亲水性代谢产物的检测结果中，共有以氨基酸、有机酸、核酸类代谢产物为主的50种组分。基于各组分对内标物质峰面积比，利用 SIMCA16 软件进行了主成分分析。图4、5分别所示为短链脂肪酸、有机酸分析以及亲水性代谢产物同时分析时的得分图和载荷图。在第1主组分轴观察到了保存温度造成的影响。 在40℃下保存的唾液中含有琥珀酸和谷氨酸等特征性物质。在25℃下保存的唾液中含有丙酮酸、组氨酸、酪氨酸等特征性物质。在4℃、-80℃下保存的唾液中，短链脂肪酸、有机酸、氨基酸、核酸类代谢产物的倾向类似，几乎所有组分均未观察到较大的浓度变化。 R2X1]=0.817， R2X[2]=0.173，椭圆： Hotelling's T2 (95%) 图4短链脂肪酸、有机酸分析中的主成分分析结果 R2X[1]=0.754， R2X[2]=0.189 图5亲水性代谢产物同时分析的主成分分析结果 图6所示为因保存温度的差异而出现较大浓度变化的代谢产物峰面积比波动。从中可知，精氨酸、谷氨酸、组氨酸等的氨基酸以及乳酸、丙酮酸、琥珀酸等的有机酸会因保存温度的不同而出现较大的变化。出现这种变化的原因之一是唾液中存在的口腔细菌在保存期间消耗或产生了这些组分。 总结 综上所述，通过使用 LC/MS/MS 进行唾液的代谢组学分析，可以全面分析口腔细菌产生的亲水性代谢产物。该分析方法在口腔细菌群研究的代谢组学分析中非常有效。 40 20 0 25℃ 40°℃ 0.4 0.2 0 图6唾液中短链脂肪酸、有机酸的变化趋势 本文件中记载的产品尚未作为医疗器械得到医药品医疗器械法的批准和认证。 无法用于治疗诊断目的，无法通过正常程序使用。 LCMS、Nexera、lonFocus、Peakintelligence 和 LabSolutions Insight 是岛津制作所株式会社在日本及其他国家的商标SIMCA 是 Sartorius Stedim Data Analytics AB 的注册商标。 ( 岛津企业管理(中国)有限公司岛津(香港)有限公司 ) ( http：//www.shimadzu.com.cn ) ( *本资料未经许可不得擅自修改、转载、销售； ) ( *本资料中的所有信息仅供参考，不予任何保证。如有变动，恕不另行通知。 ) 近年来，代谢组学技术因其能全面分析体内代谢产物而成为研究热点。代谢组学分析是指全面分析经细胞活动产生的氨基酸和有机酸等低分子代谢产物，明确多个试样群中差异的学术领域，与其他组学相比，对象组分较少，因而易于进行全面分析。      本报告介绍了一个案例，使用高速液相色谱质谱仪（LC/MS/MS）进行唾液代谢组学分析。众所周知，唾液中含有口腔细菌产生的代谢产物，同时含有口腔细菌。因此，因口腔细菌的作用而在唾液中含有的代谢产物数量会受到分析之前的唾液保存状态的影响。因此，使用代谢组学分析调查了保存温度对唾液所含代谢产物的影响。