中药舒筋活血制剂中化学成分检测方案(液相色谱仪)

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采用全二维液质联用 (LCxLC-Q-TOF)方法系统表征中药舒筋活血制剂的化学成分 本应用介绍了一种利用 Agilent 1290 Infinity ll 全二维液相色谱系统结合 Agilent 6545四极杆飞行时间液质联用 (Q-TOF) 系统，对中药舒筋活血制剂中的化学物质基础进行系统表征分析的方法。为充分扩大第一维和第二维的分离选择性差异，选择氰基柱 (CN)结合甲醇的流动相体系作为第一维的主要分离条件，并选择极性嵌入反相柱 (Bonus-RP) 结合乙腈流动相体系作为第二维分离条件。根据第一维流速和定量环体积大小，确定第二维梯度时间和调制时间，并对第二维的从动梯度进行优化。结果表明，本文所构建的全二维分析方法的峰容量得到显著提升，在 UV 277 nm 下共检测到268个比较明显的斑点；在质谱中共检测到493个斑点。结合 PCDL数据库，对主要点点进行了鉴定。利用本文所述在线全二维液质联用方法，可以更有效地对中药复杂体系的化学物质基础进行系统表征分析。 中药复方及其制剂是临床应用的主要形式。舒筋活血制剂是由红花、香附等10味中药组成的成方制剂，具有活血散瘀、舒筋活络的功效，主要用于治疗筋骨疼痛、跌打损伤、类风湿关节炎等。国内该制剂的生产厂家众多，且剂型包括片剂、胶囊和丸剂等，临床疗效确切。但是，目前由于有关该制剂化学物质基础的研究较为薄弱，现行质量标准无法满足该成方制剂的整体质量控制要求。为提升此类制剂的质量评价体系，保证中药质量和功效的一致性，需要对中药制剂的化学物质基础进行深入研究。 根据已有文献，该中药制剂主要含有黄酮类、有机酸类(原儿茶酸、迷迭香酸等)、强心苷类、醛类化合物(4-甲氧基水杨醛)、生物碱类、苯丙素类(如紫丁香苷)和木脂素等化合物。这些化合物种类复杂、结构多样，难以通过常规一维液相系统得到分离。 Davis等人”指出，当色谱峰数量超过峰容量37%时，系统分离度会大大降低。结合两种不同分离模式的二维液相色谱可显著提升系统峰容量2。近年来，全二维液相色谱的高效分离与高分辨质谱的快速定性相结合，在中药表征分析中得到越来越广泛的应用13-4，已成为高效表征复杂组分化学物质基础的重要手段。 本研究利用 Agilent 1290 Infinity ll 全二维液相色谱系统，通过对整体条件的优化组合，成功构建了一种全二维液相色谱方法；同时采用在线联用 Agilent 6545 四极杆飞行时间液质联用(Q-TOF)系统，并结合中药高分辨数据库匹配，实现了对中药舒筋活血制剂中主要成分的快速定性分析(见图1)。 图1.利用 LCxLC全二维液相色谱系统对舒筋活血中药成方制剂的化学表征分析 试剂和样品 甲酸为色谱级，购自 DikmaPure 公司。甲醇、乙腈为质谱级，购自 J.T. Baker公司(美国)。高纯水来自 Milli-Q纯水机系统(美国)。样品为舒筋活血片，市售药品。取5片研磨成粉末，然后称取适量细粉，用甲醇超声提取30 min， 将提取溶液过滤后进样分析。 仪器和设备 采用耐压高达1300 bar 的 Agilent 1290 Infinity II二维液相色谱系统。该系统由以下模块组成： ( - Agilent 1290 Infinity ⅡI二元液相色谱 泵 (部件号G7120A)，2个 ) ( - Agilent 1290 Infinity ll高性能自动进样 器 (部件号G7167B) ) ( - Agilent 1290 Infinity MCT 柱 温箱 ( 部件号G7116B) ) ( - A gilent 1290 Infinity II DAD( 部 件号 G7117B)， 2 个 ) ( - Agilent 1290 Infinit y 阀驱动(部件号 G1170A)，带2位/ 4 通双向阀(二维液相色谱阀头，120 0 bar，部件号5067-4214 ， 配备两个 60pL定量环) ) 质谱系统采用 Agilent 6545 四极杆飞行时间液夜联用(Q-TOF)系统，配备喷射流 ESI 离子源(部件号 G6545B) ( 软件采用 ) ( Agilent OpenLab Chemstation 版软件，版 本 C.01.08[27] ) Agilent 1290 Infinity 二维液相色谱采集软件，版本 A.01.04 SR2[24] ( Agilent MassHunter 工作站软件，用于 Agilent 6200 系列 TOF/6500 系列 Q-TOF 的 LC/MS数据采集(版本10.1)以及定性分析(版 本10.0) ) ( 用于二维液相色谱数据分析的 GC Image LCxLC-HRMS 版软件，版本2.5b， 来自 GC Image LLC.， Lincoln， NE， USA ) 色谱条件 第一维 色谱柱： Agilent ZORBAX SB-CN， 1.0×100mm， 3.0pm 溶剂A： 水+0.1%甲酸 溶剂B： 甲醇 流速： 0.05 mL/min 梯度： 时间 (min) B(%) 5 2 5 停止时间： 60 min 后运行时间： 10 min 第二维 色谱柱： Agilent InfinityLab Poroshell Bonus， 3.0×50 mm，2.7 pm溶剂A： 水+0.1%甲酸溶剂B： 乙腈+0.1%甲酸 流速： 2.5 mL/min 从动梯度： 梯度起点： 0.0-7.2 min， 5%B； 7.2-15.6 min， 5%-9%B； 15.6-23.8 min， 9%-10%B； 23.8-25.6 min， 10%-14%B； 25.6-29.4 min， 14%-16%B； 29.4-39.6 min， 16%-30%B； 39.6-45 min， 30%-39%B； 45-49.6min， 39%B； 49.6-54.4 min， 39%-60%B； 54.4-60 min，60%B； 梯度终点： 0-7.2 min，10%B； 7.2-7.6 min， 10%-13%B； 7.6-26.2 min， 14%-40%B； 26.2-29.8 min， 40%-46%B； 29.8-39.9min， 46%-66%B； 39.9-50.2 min， 66%-89%B； 50.2-55 min， 89%-95%B； 55-60 min， 95%-98%B 第二维梯度时间： 0.40 min 调制时间： 0.60 min 柱温箱： 第一维在右侧温区，柱温为 30℃； 第二维在左侧温区，柱温为40℃ DAD 主要参数： 277 nm， 扫描范围：210-400 nm 质谱条件 干燥气温度 320°C 气体流速： 8 L/min 雾化器压力： 35 psi 鞘气温度： 350°C 鞘气流速： 11L/min 毛细管电压： 3500V 喷嘴电压： 1000V 碎裂电压： 150V 锥孔电压： 65V 八极杆RFVpp： 750V 质量数范围(MS)： ：100-1100 质量数范围 (MS/MS)： 25-1100 采集速率： 10幅谱图/秒 分离峰宽： 窄 (约1.3m/z) 碰撞能量： 20V 进入MS前，采用三通分流，分流比约为1：4 结果与讨论 第一维和第二维色谱分离模式组合及其条件选择 为最大程度利用二维分离空间，并有效提升系统峰容量，尽量保持第一维与第二维分离的正交性或选择性差异至关重要。色谱柱及其化学键合相是影响选择性的重要因素。色谱柱的选择既要考虑目标分析物的种类和理化性质，也要考虑流动相的兼容性和溶剂效应等因素。目前， RPxRP 组合是全二维液相色谱中应用最多的一种分离模式组合合。其优势在于， RP中可供选择的化学键合相种类丰富，流动相兼容性较好，并且可通过色谱柱的灵活搭配减小一维对二维的溶剂效应等。本研究也采用 RPxRP 组合。 基于复方中单味药组成，虽然对样品中包含的化合物种类有一定认识，但由于无法获知其整体化学组成信息，因此初始实验主要基于 Snyder 和 Dolan的疏水减法模型 (Hydrophobic SubtractionModel， HSM) 选择正交性差异较大的组合方式。HSM 模型将被分析物在RP色谱柱上的保留特性分成5种：疏水保留性(n)、空间位阻(o')、氢键的碱性(β')、氢键的酸性(a)和离子交交特性(K)等。H、S*、A、B和C是与被分析物5种保留特性相关的固定相特征系数。公式(1)决定了分析物在 RP 色谱柱上的保留行为。利用公式(2)计算选择性因子大小，可用于评估大部分 RP 色谱柱的选择性差异。如果两个 RP 固定相的F，值小于3，则两个固定相之间的平均选择性差异较小，可互为替代。反之，如果Fs大于50，则可以认为这两种固定相的差异较大。在第一维和第二维分离中，分别采用氰基柱(CN)和极性嵌入反相柱 (Bonus-RP)。这两种色谱柱的 Fs= 50.02，选择性差异显著。在流动相的选择上，同样出于最大程度增加第一维与第二维的选择性差异的考虑，在第一维和第二维分离中分别采用甲醇体系和乙腈流动相体系。 为充分发挥第二维的分离能力，本研究选择 Poroshell 120 Bonus-RP (50 mmx 3.0 mm， 2.7 pm) 色谱柱，并确定第二维有效梯度时间为 0.4 min。在此基础上，为兼顾第一维分离效率，选择规格为1 mmx100 mm， 3.5 pm 的 ZORBAX SB-CN 色谱柱，并采用55 min 的长梯度。根据第一维和第二维的全波长扫描结果，并结合已知文献的报道，确定采集波长为277nm。 在RPxRP的组合中，采用从动梯度 (shift gradient) 能够扩大并有效利用分离空间，弥补第一维与第二维正交性的不足，从而改善系统的分离能力。本研究采用二维色谱专用软件，基于第一维的分离概况灵活调整第二维梯度的起点和终点。最终优化得到的第一维和第二维梯度曲线如图2所示。按照优化后的色谱条件得到的全二维分离的轮廓线图如图3所示。从中可以看出，总体而言，通过第一维分离得到的所有馏分在第二维保留适中且分离良好。 图2.第一维梯度及第二维优化后的从动梯度 图3.样品提取溶液的 LCxLC轮廓线图 基于全二维(LCxLC) 的样品分离结果及典型斑点的定性鉴别 采用构建的在线 LCxLC 系统，通过 DAD 在 277 nm 下木测则268个斑点，并且在设定相应的峰面积和体积阈值后，通过 MS检测到493个较为明显的斑点。典型斑点及其对应的第二维分离结果如图4A 所示。-一维叠加峰在第二维获得了较好的分离。在 第一维分离结果中， RT 30-50 min范围内的色谱峰比较集中且重叠现象较严重。借助第一维分离，仅检测到具有明显峰顶点的色谱峰34个。而借助第二维分离，在该区间间共检测到约126个斑点，其中相对含量较高的斑点为10-21。根据图5中主要斑点的UV 光谱结果，可以将化合物大体分为四类，涵盖该中药制剂样品的主要化学结构类型。 图4.样品中的典型斑点及其对应的第二维分离图(A)，以及第一维 RT 30-50 min范围内斑点较密集的区域(B) 图5.样品轮廓线图中各特征斑点对应的UV吸收光谱 进一步结合在线联用Q-TOF 平台，对中药舒筋活血制剂的化学成分进行定性分析。以图4A中的两个典型斑点3和4为例进行说明。首先，利用高分辨质谱获得的准分子离子峰的精确质量数(m/z 分别为 179.0350 和353.0881)及其相应的同位素分布情况(图6)来确定化合物的分子式。由此得到斑点3和4的分子式分别为 C9Hg04 和 C16H1809， 精确质量数偏差分别为 0.83 ppm和 0.02 ppm，12一级匹配综合得分分别为98.8分和99.8分。然后利用20 eV 碰撞能量下获得的二级质谱图，镜像匹配中药数据库中的二级谱图，快速锁定目标成分的化学结构式。由此推测斑点 ×105 响应 vs. 质荷比(m/z) 3和4分别为咖啡酸和绿原酸，，二二级谱图相似度得分大于85分。根据这一策略，利用在线 LCxLC-Q-TOF 系统并结合中药高分辨数据库，能够对舒筋活血制剂中的化学成分逐一定性分析。本文由于篇幅有限，仅对第一维分离结果中 RT 30-50 min 范围内的明显斑点10-21逐一匹配鉴定，得到其分别对应于柚皮素-葡萄糖苷异构体、皮素-7-0-B-D-葡萄糖苷、松脂素、络石苷、圣草酚、五脂素A1、橙皮素、木犀草素等天然产物，涵盖黄酮类、木脂素、酚类、有机酸及苯丙素类等(图4B)。 ×102 Product lon (rt： 19.065， 19.067 min， 2 scans) (179.0356[z=1]) 响应 vs. 质荷比(m/z) 全二维(LCxLC) 系统评价 根据系统峰容量和正交性，对构建的在线全二维液相色谱系统进行评价。理论峰容量按照'n×2n。进行计算，但实际受到采样不足或再混合的影响，实际有效峰容量通常根据 Davis-Stoll-Carrl9准则进行校正(公式3)。由此得到本方法的第一维峰容量为174.8，第二维峰容量为27.0，理论峰容量为4714.9，有效峰容量为2149.9。表明与一维分离相比，全二维方法的峰容量提高了近12倍。 n'c.2D 为二维有效峰容量；'n。为第一维峰容量；?n。为第二维峰容量；?t。为第二维循环分析时间；1；'t。第一维梯度时间。 为评估本方法对分离空间的覆盖率和利用度，采用Gilar 提出的校正模型10进行正交性评价。将整个分离空间分成16×16个方块，结果数据点占据的面积为总面积的48%(理想的正交系统覆盖率达到63%即代表100%正交性)；正交性(0)结果为63.2%(公式4)。通过这种方法所计算得出的实际峰容量为2163.9(公式5)，与 Davis-Stoll-Carr 准则的计算结果基本一致。 Xbins，包含有数据点的所有 bins 的总和； Pmax； 所有 bins 中总峰容量。 实际峰容量Np， P和P2分别为第一维和第二维的峰容量。 结论 本应用基于 Agilent 1290 Infinity Ⅱl二维液相色谱系统，通过对第一维和第二维色谱柱、流动相及第二维从动梯度等主要条件进行优化，构建了基于 RPxRP组合的在线全二维液相色谱系统，并结合Q-TOF 对舒筋活血制剂的化学成分进行了表征。与常规的UHPLC 分析相比， LCxLC 系统显著提升了峰容量，显著增加了分离并鉴定出的化合物数量。在实际分析工作中， UHPLC-MS/MS与 LCxLC-MS/MS 互为印证和补充， 可极大改善有关中药化学物质基础研究的效率和质量，助力中药现代化进程。 ( 参考文献 ) ( I.L Davis J.M.， Giddings J.C. 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Chem.，2005，77：6426-6434 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 右线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 ( 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。 ) ( @安捷伦科技(中国)有限公司，2021 ) ( 2021年01月08日，中国出版 ) ( 5994-2966ZHCN ) 本应用介绍了一种利用 Agilent 1290 Infinity Ⅱ 全二维液相色谱系统结合 Agilent 6545 四极杆飞行时间液质联用 (Q-TOF) 系统，对中药舒筋活血制剂中的化学物质基础进行系统表征分析的方法。为充分扩大第一维和第二维的分离选择性差异，选择氰基柱 (CN) 结合甲醇的流动相体系作为第一维的主要分离条件，并选择极性嵌入反相柱 (Bonus-RP) 结合乙腈流动相体系作为第二维分离条件。根据第一维流速和定量环体积大小，确定第二维梯度时间和调制时间，并对第二维的从动梯度进行优化。结果表明，本文所构建的全二维分析方法的峰容量得到显著提升，在 UV 277 nm 下共检测到 268 个比较明显的斑点；在质谱中共检测到 493 个斑点。结合 PCDL 数据库，对主要斑点进行了鉴定。利用本文所述在线全二维液质联用方法，可以更有效地对中药复杂体系的化学物质基础进行系统表征分析。