鱼肉中竹桃霉素、红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、吉他霉素、交沙霉素、螺旋霉素、替米考星、秦乐菌素检测方案(液质联用仪)

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SSL-CA20-379Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-513 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.- Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LCMS-8045 检测鱼肉中大环内酯类抗生素 LCMSMS-513 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-40 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8045 联用快速测定鱼肉中大环内酯类抗生素的方法。鱼肉样品经处理后，经LCMS-8045分析，9种大环内酯类抗生素在1-1000ug/L浓度范围内线性良好，标准曲线的相关系数均在 0.997以上；对1 ug/L、20 ug/L 和250 ug/L混合基质标准溶液进行精密度实验，连续6次进样保留时间和峰面积相对标准偏差分别在0.02%~0.20%和0.72%~9.41%之间，仪器精密度良好。加标浓度在5 ug/kg 的鱼肉样品，回收率在76.3%~96.7%之间。 关键词：大环内酯类抗生素 三重四极杆质谱普兽药残留 大环内酯类抗生素(Macrolide anti-biotics， MALs)是由放线杆菌或小单孢菌产生的一类抗生素。 MALs 已经成为全世界需求量和销售速度增长最快的抗生素之一。由于 MALs 具有广谱抗菌作用，可抵抗革兰氏阳性菌、支原体和部分革兰氏阴性菌，因此被广泛应用于治疗猪、牛、羊、虾及家禽的呼吸性和倡导传染性疾病，或在低剂量下作为饲料添加剂促进动物生长发育。大环内酯类药物残留可引起过敏反应和导致携带耐药因子的菌株扩散。和其他兽药一样，大环内酯类药物在动物源性食品中的残留监测与控制已经受到许多国家包括我国政府的高度重视。 《GB 31650-2019食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》规定， 红霉素在鱼和其其动物组织中的最大残留限量(MRL)为40~200 pg/kg；吉他霉素、螺旋霉素、替米考星和泰乐菌素在动物组织的 MRL 分别为200 ug/kg、200~800 ug/kg、50-2400 ug/kg和100-300 ug/kg. 本文使用岛津超高效液相色谱仪 LC-40和三重四极杆质谱仪 LCMS-8045联用，参考《GB 31660.1-2019水产品中大环内酯类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》建立了测定鱼肉中9种大环内酯类抗生素(竹桃霉素、红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、吉他霉素、交沙霉素、螺旋霉素、替米考星、秦乐菌素)的分析方法，该方法分析速度快、重复性好、灵敏度高，可供相关检测人员参考。 本实验采用岛津 Nexera LC-40 X3 与三重四极杆质谱仪 LCMS-8045 联用系统。具体配置为： 系统控制器：CBM-40自动进样器： SIL-40CX3输液泵： LC-40BX3质谱仪： LCMS-8045柱温箱： CTO-40S色谱工作站： LabSolutions Ver. 5.97 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱谙： Shim-pack GIS C18(150 mm×2.1mml.D.，4 um，岛津(上海)实验器材有限公司， P/N：227-30097-07) 流动相：A-0.1%甲酸水溶液；B一乙腈 流速：0.3mL/min 进样体积：2uL 柱温：40℃ 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为15%。 表1 梯度洗脱时间程序 Time (min) Module Command Value 1.00 Pumps Pump B Conc. 15 6.00 Pumps Pump B Conc. 65 6.50 Pumps Pump B Conc. 95 7.50 Pumps Pump B Conc. 95 7.51 Pumps Pump B Conc. 15 10.00 Controller Stop 质谱条件 离子源： ESI，正离子模式 DL 管温度：250℃ 离子源接口电压：1.0kV雾化气：氮气3.0L/min干燥气：氮气10 L/min 加热模块温度：400℃ 接口温度：300℃ 扫描模式：多反应监测(MRM) 加热气：空气10 L/min MRM参数：见表2 碰撞气：氩气 驻留时间： 3~25 ms 表2 MRM 参数 编号 名称 英文名称 CAS号 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias(V) CE(V) Q3 Pre Bias(V) 1 螺旋霉素 Spiramycin 8025-81-8 843.5 174.1* 142.2 -24.0 -24.0 -36.0 -34.0 -12.0 -15.0 174.2 -24.0 -45.0 -19.0 2 替米考星 Tilmicosin 108050-54-0 869.6 696.6* -24.0 -42.0 -26.0 158.1 -20.0 -28.0 -17.0 3 竹桃霉素 Oleandomycin 7060-74-4 688.5 544.4* -20.0 -17.0 -20.0 174.2* -26.0 -39.0 -12.0 4 秦乐菌素 Tylosin 1401-69-0 916.6 772.6 -26.0 -31.0 -30.0 158.1* -32.0 -25.0 -12.0 5 克拉霉素 Clarithromycin 81103-11-9 748.5 590.4 -32.0 -16.0 -20.0 158.1* -22.0 -36.0 -30.0 6 阿奇霉素 Azithromycin 83905-01-5 749.5 591.4 -22.0 -29.0 -22.0 158.2 -26.0 -32.0 -29.0 7 红霉素 Erythromycin 114-07-8 734.4 576.3* -26.0 -21.0 -28.0 8 交沙霉素 Josamycin 16846-24-5 828.5 109.1 174.2* -24.0 -24.0 -35.0 -33.0 -21.0 -18.0 109.1 -22.0 -41.0 -22.0 9 吉他霉素 Sineptina 1392-21-8 772.5 174.1* -22.0 -32.0 -12.0 *表示定量离子 1.3样品制备 标准溶液配制： 精密量取含竹桃霉素、红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、吉他霉素、交沙霉素、螺旋霉素、替米考星、秦乐菌 素9种标准物质的 100 ug/mL的混合标准贮备液1mL， 于10mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为 10 ug/mL 大环内酯类药物混合标准工作液。 精密量取混合标准工作液适量，用空白样品提取液溶解稀释，配制成大环内酯类药物浓度为1ng/mL、5ng/mL、20 ng/mL、100 ng/mL、250 ng/mL、500 ng/mL 和1000 ng/mL的系列基质标准工作溶液，现配现用。 样品前处理方法： 鱼肉样品的提取和净化参照《GB 31660.1-2019食品安全国家标准水产品中大环内酯类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》。 结果与讨论 2.1标准样品的 MRM 色谱图 图1l：大环内酯类抗生素基质标准样品的 MRM 色谱图(5ng/mL) 2.2线性关系 精密量取混合标准工作液适量，用空白样品提取液溶解稀夜，配成浓度为1、5、20、100、250、500和1000 pg/L的系列标准工作溶液，按1.2中的分析条件进行测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制校准曲线如图2所示。9种大环内酯化合物在1-1000 ug/L 浓度范围内线性良好，线性方程、相关系数见表3。以1ng/mL 大环内酯类抗生素的 MRM 色谱图结果，根据检出限MDL= 3.3 S/N， 定量限LOQ=10 S/N，计算检出限和定量限，结果见表3。 阿奇霉素 螺旋霉素 图299种大环内酯类抗生素的标准工作曲线 表3 9种大环类抗生素的校准曲线参数 No. 名称 校准曲线 相关系数r 准确度% 检出限(ug/L) 定量限(ug/L) 1 阿奇霉素 Y=(4926.10)X+(2305.84) 0.9988 77.9~112.3 0.081 0.271 2 螺旋霉素 Y=(3499.21)X+(-1287.64) 0.9990 82.6~115.7 0.193 0.642 3 替米考星 Y=(955.844)X+(-22.1847) 0.9994 88.4~114.7 0.235 0.784 4 竹桃霉素 Y=(21538.8)X+(21212.1) 0.9986 71.8~117.4 0.002 0.005 5 红霉素 Y=(10443.0)X+(10719.7) 0.9975 75.3~116.7 0.020 0.067 6 泰乐霉素 Y=(13773.0)X+ (5926.66) 0.9989 79.0~115.5 0.029 0.096 7 吉他霉素 Y=(21836.2)X+(15719.5) 0.9993 77.6~114.3 0.025 0.083 8 克拉霉素 Y=(40631.0)X+(51880.8) 0.9973 74.6~119.4 0.005 0.017 9 交沙霉素 Y=(40631.0)X+(51880.8) 0.9979 85.6~124.7 0.011 0.037 2.3精密度实验 对1ug/L、20 ug/L和 250 ug/L混合基质标准溶液连续6次进样，考察仪器的精密度，保留时间和峰面积的重复性结果如表4所示。3个浓度标准品的保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.02%~0.20%和0.72%~9.41%之间，仪器精密度良好。 表4 保留时间和峰面积重复性结果(n=6) 样品名称 RSD% (1mg/L) RSD%6(20mg/L) RSD% (250 mg/L) R.T Area R.T Area R.T Area 阿奇霉素 0.18 7.84 0.07 3.82 0.06 1.52 螺旋霉素 0.20 7.20 0.07 2.42 0.07 1.57 替米考星 0.09 9.41 0.06 4.40 0.05 1.98 竹桃霉素 0.04 6.13 0.05 4.01 0.09 1.46 红霉素 0.05 5.01 0.03 1.22 0.06 0.72 泰乐霉素 0.11 3.35 0.02 2.04 0.06 1.95 吉他霉素 0.06 5.04 0.04 1.64 0.05 0.97 克拉霉素 0.04 6.68 0.05 2.62 0.06 1.66 交沙霉素 0.04 4.59 0.04 1.63 0.05 1.03 2.4实际样品分析及基质加标实验 取市售鱼肉样品，平行制备两份，上机测定，样品未检出大环内酯类抗生素。为了考察方法的准确度，在空白鱼肉基质中加标，加标浓度为5 ug/kg， 平行测定3次，然后再按照1.3中样品制备方法提取净化的鱼肉基质样品后分析，其回收率在76.3%~96.7%之间，具体数据见表5。 图39实际空白鱼肉样品及加标样品 MRM重叠色谱图(绿线和蓝线分别为空白鱼肉和加标鱼肉样品) 表5 鱼肉加标回收率结果(n=3) 阿奇霉素 螺旋霉素 替米考星 竹桃霉素 红霉素 泰乐霉素 吉他霉素 克拉霉素 交沙霉素 回收率% 84.5 82.7 76.3 93.0 89.6 79.5 95.4 94.3 96.7 重复性% 8.65 9.77 11.44 4.37 8.46 7.87 6.83 6.40 5.49 结论 建立了使用岛津超高效液相色谱仪 LC-40和三重四极杆质谱质 LCMS-8045联用测定鱼肉中9种大环内酯类抗生素的方法。该方法分析速度快，灵敏度高，精精度良好；竹桃霉素、红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、：吉他霉素、交沙霉素、螺旋霉素、替米考星、秦乐菌素在 1-1000 ug/L 浓度范围内线性良好，所有样品的标准曲线的相关系数均在 0.997 以上。对1 ug/L、20 ug/L 和 250 ug/L 混合基质标准溶液进行精密度实验，连续6次进样保留时间和峰面积相对标准偏差分别在0.02%~0.20%和0.72%~9.41%之间，加标浓度为 5 ug/kg 的鱼肉样品，其回收率在76.3%~96.7%之间。 岛津应用云 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪LC-40和三重四极杆质谱仪LCMS-8045联用快速测定鱼肉中大环内酯类抗生素的方法。鱼肉样品经处理后，经LCMS-8045分析，9种大环内酯类抗生素在1-1000   µg/L浓度范围内线性良好，标准曲线的相关系数均在0.997以上；对1 µg/L、20 µg/L和250   µg/L混合基质标准溶液进行精密度实验，连续6次进样保留时间和峰面积相对标准偏差分别在0.02% ~0.20%和0.72% ~9.41   %之间，仪器精密度良好。加标浓度在5 µg/kg的鱼肉样品，回收率在76.3%~96.7%之间。