牛奶中三聚氰胺检测方案

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分子印迹固相萃取柱净化-——-GC-MS/MS法测定牛奶中三聚氰胺 (北京普析通用仪器有限责任公司) 1.方法概述 本方法利用三聚氰胺分子印迹固相萃取柱对牛奶样品进行(富集)净化，与国标方法相比操作更简便，提取后无需再过滤、萃取等其他步骤，直接稀释上柱净化；在实验中直接用单一的乙腈溶剂一次就可以提取完全，节省了溶剂使用量；通过分子印迹柱的净化，有效的消除样品中基质干扰，提高了检出能力。 2.适用范围 牛奶中三聚氰胺的检测。 3.仪器与试剂 3.1仪器与设备 高效液相色谱-串联质谱联用仪，配有电喷雾离子源(ESI)；电子天平，固相萃取装置，涡旋混合器，微量移液器，离心机，氮吹仪，超声波清洗器等。 3.2式剂 三聚氰胺分子印迹固相萃取柱(40mg/3mL，北京普析通用仪器有限责任公司)，乙腈(色谱纯)，甲醇(色谱纯)，乙酸(色谱纯)，乙腈-10mmol/L 乙酸铵溶液(5+95，体积比)，甲醇乙酸(9：1)，三聚氰胺标准品(CAS：108-78-1)。 4.分析步骤 4.1试样提取 称取1g(精确至0.01g)样品于50mL离心管中，加入18mL乙腈溶液，充分混匀，漩涡震荡 lmin， 超声提取15min。离心机10000r/min 离心 10min。转移全部溶液用乙腈定容到20mL。再移取定容溶液1mL用乙腈定容到3mL， 待净化。 4.2净化 预淋洗：乙酸：甲醇(1：9)3mL预淋洗。 活化：3mL甲醇活化 平衡：3.3mL水平衡，保证水未流干。 上样： 将上述待净化的溶液取 1.5mL 上柱 淋洗：4mL乙腈淋洗，完全抽干。 洗脱：用4mL的乙酸：甲醇(1：9)和2ml甲醇洗脱固相萃取柱，彻底抽干，收集洗脱液，40℃N2 吹干，乙腈-10mmol/L乙酸铵溶液(5+95，本积比)复溶。旋涡震荡 1min， 3min 超声混匀。将溶液用0.2um 有机相滤膜过滤后供液相色谱串联质谱测定。 注：：上样和洗脱时流速不易太快不超过 1mL/min。 4.3 标准曲线制作 标准物质储备液(25g/mL)：根据标准物质储备液单标的含量，精确移取标准物质储备液，并用乙腈定容，标准物质的浓度均为25 ug/mL。此溶液置于-4℃下冷藏。 标准物质中间液(500ng/mL)：移取 25g/mL混合标准物质储备液0.2mL 于10mL容量瓶中，用乙腈-10mmol/L乙酸铵溶液(5+95，体积比)稀释至刻度，摇匀，得到500ng/mL 溶液，备用。 分别准确移取混合标准物质中间液 (500ng/mL)适量，并用乙腈-10mmol/L乙酸铵溶液(5+95体积比)稀释得到以下浓度的标准工作液(见表1)，经0.2um微孔滤膜过滤，备用。 表1标准工作液浓度 序号 1 2 3 4 5 工作液浓度 ng/mL 20 40 60 80 100 混合标准物质中间液(500ng/mL)体积uL 40 80 120 160 200 定容体积 mL 1 4.4 测定条件 1)液相仪器条件 色谱柱： Shim-pack GIST C18 (2.1mm，775mm×2Hm) 柱温：40℃ 进样量：1儿 流动相A：1：10mmol/L乙酸铵溶液 流动相B： 乙腈 泵模式：：二元高压梯度 总流速： 0.4mL/min 2)质谱条件 离子源： ESI，正离子模式 毛细管电压：4000v 毛细管温度300℃ 雾化器流量：3.0L/min 碰撞气类型：氩气 扫描方式：多反应监测 监测离子：见表2 表2被测的母离子和离子参数表 被测物名称 定性离子对 (m/z) 驻留时间 (msec) Q1(V) CE Q3(V) 三聚氰胺 127.1>85* 127.1>65 3030 -12-12 -20-30 -18-27 注：质谱中被测的母离子和离子参数均为使用仪器优化出的最佳条件。 5.结果与分析 5.1 标准曲线绘制 将三聚氰胺标准溶液(3.3)按上述测定条件进样，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，标准曲线结果见图1。 图1三聚氰胺标准曲线图 5.2检出限 按照以下公式进行方法检出限的计算。 式中： S一为噪声的3倍，即仪器能辨认的最小的物质信号； b 一标准曲线回归方程的斜率。 检出限为 0.0076mg/kg 5.3精密度 对同一牛奶样品平行样连续测定7次，用相对标准偏差表示，结果试验数据见表3. 表3方法精密度实验结果 样品编号 1 2 3 4 5 6 7 均值 RSD(%) 检测结果(ng/mL) 52.842 51.581 52.533 52.375 51.076 52.238 51.405 52.007 1.26 此方法精密度为1.26%，小于10%。 5.4回收率 7个牛奶加标平行样回收率见表4。 表4牛奶加标回收率实验结果 样品名称 化合物名称 添加浓度(mg/kg) 取样量(g) 实测值 (mg/kg) 回收率 (%) 牛奶 三聚氰胺 2.5 1 2.114 84.55 2.5 2.063 82.53 2.5 2.101 84.05 2.5 2.095 83.80 2.5 2.043 81.72 2.5 2.089 83.58 2.5 2.056 82.25 牛奶中三聚氰胺检测回收率在 81.72%-84.05%之间。 5.5三聚氰胺分子印迹柱净化效果图 由实验可知，，牛奶加标样品的基线有杂峰(图1)，会干扰测定，而经分子印迹柱处理牛奶加标样品，谱图平整无干扰(图2)，与三聚氰胺标准溶液的基线类似(图3)，，1可见分子印迹固相萃取柱有良好的净化效果。 图1 牛奶样品谱图 图2 经分子印迹柱处理的牛奶加标谱图 图3三聚氰胺标准溶液(100ppb)谱图 本方法利用三聚氰胺分子印迹固相萃取柱对牛奶样品进行（富集）净化，与国标方法相比操作更简便，提取后无需再过滤、萃取等其他步骤，直接稀释上柱净化；在实验中直接用单一的乙腈溶剂一次就可以提取完全，节省了溶剂使用量；通过分子印迹柱的净化，有效的消除样品中基质干扰，提高了检出能力。