牛血清白蛋白中鉴定研究检测方案(液质联用仪)

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SSL-CA22-009Excellence in Science Excellence in ScienceLCMS-QTOF-040 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.- Analytical Applications CenterTel： 86(21)34193996Email： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn LCMS-9030用于牛血清白蛋白的鉴定研究 LCMS-QTOF-040 摘要：本文采用岛津LCMS-9030 飞行时间高分辨液质联用仪对牛血清白蛋白 (BSA) 进行鉴定研究，并结合岛津LabSolutions 和 pFind 软件对 BSA 酶解肽段进行匹配打分。结果显示，在胰蛋白酶酶切的情况下，使用两种计算软件对 BSA二级结构确认的匹配度分别为82.4%和85.7%。利用 Byonic 软件对肽段上的修饰基团进行解析，结果显示，除固定修饰乙酰胺化外， BSA 仅存在少量的N-脱酰胺 (Deamidated)等可变修饰。该方法快速、准确，分析精确度高，为蛋白类样品的肽质谱图分析提供参考。 关键词：Q-TOF蛋白组学 BSA 基于液质联用技术的蛋白鉴定研究主要有两种思路：自下而上(Bottom-up) 和自上而下(Top-down)。最常用的是“自下而上”，也就是我们常说的鸟枪法(shotgun)，是一种依赖数据库的策略，它充分利用了蛋白质自身的特点，即蛋白质可以被特定的酶在特定的位点酶切，酶切所获得的特异性肽段在质谱二级碎片分析时，通常会形成三种特征离子by 离子， ax离子和cz 离子。通过质谱测定这些特征的二级碎片信息，结合理论谱库相似度匹配，从而实现肽段的鉴定，再根据肽段序列推导出蛋白质序列。因此肽质谱图的匹配 (Peptide Sprectrum Matching， PSM) 是一个非常重要的指标。PSM 常常借助搜库软件实现，常见的如SEQUEST、Mascot、X!Tandem、Comet以及 MaxQuant、 pFind 软件等。这些搜库软件所使用的统计学打分算法通常有两种：正反库策略 (target-decoy， TDA) 和基于经验贝叶斯(EB)的打分。对于打分结果大部分软件都要求进行假发现率 (False Discovery Rate，FDR)和酶切特异性 (Digestion Specific)控制。而PSM 匹配的准确性与未知翻译后修饰，质谱数据的质量准确度，肽段丰度等因素有关。岛津 LCMS-9030 采用了UF-FlightTube 青行管精空温控技术，保证了亚ppm的质量精度，同时，传承了 LCMS-8060 旗舰级三重四极杆质谱的高效、快速离子传输系统，结合新型漏斗形 MCP检测器， 拥有 fg级灵敏度，有利于低丰度肽段测定。 本研究采用胰蛋白酶对 BSA 进行酶切， MS Scan+DDA 进行数据采集，质谱数据经 MSConvert 软件转换为 mzML格式，经 pFind 软件(中国科学院计算所)和 Byonic 软件 (Protein Metrics Inc.) 分别进行蛋白鉴定研究，并对翻译后修饰进行分析。 1.1仪器 本实验使用高效液相色谱仪 LC-30AD 与四极杆飞行时间质谱仪 LCMS-9030联用系统。具体配置为： 系统控制器： CBM-20Alite 脱气机：DGU-20A输液泵： LC-30AD×2自动进样器：SIL-30AC柱温箱：CTO-20AC色谱工作站： LabSolutions Ver. 5.99 1.2分析条件 液相条件 色谱柱： Shim-pack GISS C18 (150 mm× 2.1 mm l.D.， 1.9 um)， PN：227-30048-03，岛津(上海)实验器材有限公司 流动相：A相-0.1%甲酸水溶液；B相-0.1%甲酸乙腈溶液 流速：0.3 mL/min 柱温：40℃ 进样体积：1uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为2%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Commanc Value 2.00 Pump B.Conc 2 30.00 Pump B.Conc 25 33.00 Pump B.Conc 60 36.00 Pump B.Conc 60 37.00 Pump B.Conc 2 40.00 Controller Stop 质谱条件 离子化模式：ESI* 加热模块温度：400℃ 雾化气流速：3.0L/min 干燥气流速：10.0 L/min 加热气流速：10.0 L/min 扫描模式：MS和 MS/MS(DDA) 接口温度：300℃ 接口电压：4.5kV DL 温度：250℃ 事件时间：0.1s 样品前处理 用50mM碳酸氢铵做溶剂，将 BSA 粉末制剂配制成 0.1 g/mL的溶液，然后用碳酸氢铵稀释至 100 ug/mL， 吸取 50 uL该溶液样品，加入47 uL碳酸氢铵溶液，加500mM二硫苏糖醇 (DTT)1 uL， 在37℃下震摇60 min， 结束后加入1.5 uL碘乙酰胺 (IAA)溶液(1M)，在室温条件下避光震摇30 min，然后加入l uL胰蛋白酶溶液(含lug胰蛋白酶)，在37℃下反应12小时，酶解结束后加入1 uL TFA 溶液终止酶解反应，然后转入低吸附PP材质的样品瓶，进行分析。 结果与讨论 3.1 BSA肽段色谱图 图1 BSA 酶解后的 BPC图 3.2肽质谱图匹配 将 LabSolutions 采集的数据直接转换为 mzML格式，导入 pFind 软件，并导入BSA 的氨基酸序列文件(P02769，UniProt)，进行多肽质谱匹配和翻译后修饰分析。 pBuild 软件用于蛋白质搜库结构查看，在控制FDR<1%条件下，有191张库匹配二级质谱图，氨基酸序列覆盖率为82.4%(图2)。酶切特异性匹配良好，总体达到98.3%。肽段 AA 长度分布6~30之间，其中15肽占比最高。实测一级质谱误差1.58±3.58 ppm，质谱质量精度优异。识别到修饰类型10种，如半胱氨酸C-乙酰胺化，C-乙酰胺化修饰 (Cam C， +57.021Da) 比例高达35.6%。除此之外，还存在赖氨酸K的乙酰胺化，N-脱酰胺化 (deamidated)， 可变修饰比例均低于3%。 图2 BSA酶解后序列覆盖图 FDR Curve 5.0% 4.0% 3.0% Diisopropylphosphate[AnyN-term] |Deamidated[N] 2.61 2.612.61 1.74 1.74 1.74 1.74 1.74 1.74 0 2 3 4 6 7 9 10 图3 PSM 结果汇总图 为了交叉验证不同软件PSM 打分结果，数据导入 Byonic 软件分析，氨基酸序列覆盖度可达85.7%，与pFind 软件计算的 PSM 结果82.4%相当。 >NP_851335.1 albumin precursor [Bos taurus] ALVELLKHKPKATEEQLKTVMENFVAFVDKCCAADDKEACFAVEGPKLVVSTQTALA 图4 覆盖度图 (Byonic) PMi-PTM 模对氨基酸进行修饰研究，修饰主要有脱酰胺 (deamidated) 氧化 (Oxidation/15.9949)、脱硫醇化 (Dethiomethyl/-48.0034)、谷氨酰胺焦谷氨酸化 (Gln->pyro-Glu/-17.0265) 等。如下图5所示，在多肽 TVMENFVAFVDK中，M发生脱硫醇化修饰，比例达到47.2%。 图5氨基酸修饰统计 (Byonic) 根据显示二级质谱图校对肽段的碎片，尤其是带修饰的碎片基团，以肽段 K.QNCDQFEK.L为例，可以根据二级质谱图清晰判断每个碎片的断裂位置以及修饰位点(图6)。 c二c一 图6 K.QNCDQFEK.L二级质谱图 3.3蛋白质鉴别 牛蛋白质组序列 (Uniprot proteome _UP000009136.fasta)，包含了牛的所有蛋白质组，将其用于二级质谱数据归属研究。经 pFind 软件计算，该样品中识别到三个蛋白，均指向牛血清白蛋白，多肽覆盖度均大于68%，如下图7。以上结果表明，在复杂的蛋白组成体系下，牛血清白蛋白鉴定结果仍然准确可靠。 # AC DE SQ Length PSM CountCoverage 1 sp|P02769|ALBU BOVIN Albumin OS=Bos taurus OX=9913 GN=ALB PE=1 SV=4 607 1 69.7%2 tr|A0A3Q1LNN7|A0A3Q1LNN7_BOVIN Albumin OS=Bos taurus OX=9913 GN=ALB PE=4 SV=1 576 1 68.2%3 tr|A0A140T897|A0A140T897_BOVIN Albumin OS=Bos taurus OX=9913 GN=ALB PE=4 SV=1 607 1 71.2% 图7牛蛋白组匹配结果(pFind) 同样地，采用 Byonic 软件进行计算，牛血清白蛋白(BOVIN Album)得分较高，获得了 74.8%的匹配度，远远高于其他蛋白质，定性匹配结果良好。如下图 8。 Rank Name |Log Prob| Log Prob| Score Spectra Peps. Peps. % Cov. # AAs Intensity 1|1 >trA0A140T897/A0A140T897 BOVIN Albumin OS.5... 288.72 11.37 841.3 855 68 6 74.8 607 1.760e+8 2|2 >sp|Q3SZR3|A1AG BOVIN Alpha-1-acid glycoprot...mm 24.82 5.66 540.3 29 12 0 43.1 202 2.849e+5 3|3 >sp|P15497|APOA1_BOVIN Apolipoprotein A-1OS... 16.30 4.63 432.1 13 8 0 31.7 265 5.289e+4 44|4 >sp|Q2UVX4|CO3_BOVIN Complement C3 OS=Bos... 8.50 5.75 494.2 13 5 0 1.9 1661 1.692e+5 ￥55|5 >sp|P41361|ANT3_BOVIN Antithrombin-IlI OS=Bo... 3.58 3.55 383.8 3 2 0 3.2 465 1.999e+4 6|6 >tr|F6RLA2|F6RLA2 BOVIN Testis specific serine ki... 2.91 2.91 412.2 1 1 0 2.5 326 3.322e+4 7|7 >trA5PJH7|A5PJH7 BOVIN LOC788112 protein OS... 2.90 2.88 253.2 2 1 0 5.2 172 7.158e+3 8|8 >sp|P02769|ALBU BOVIN Albumin OS=Bos taurus ... 2.04 1.05 304.4 46 3 0 1.6 607 1.292e+6 9|9 >tr|E1BH06JE1BH06 BOVIN C4a anaphylatoxin OS... 1.92 1.84 274.2 6 4 1 1.6 1741 4.090e+4 10|10 >tr|A0A3Q1N2C2JA0A3Q1N2C2 BOVIN Uncharact... 1.85 1.83 259.3 2 1 0 2.2 316 8.088e+4 11||11 >sp|Q3T0E2JSYCP3_BOVIN Synaptonemal complex... 1.84 1.62 319.2 14 2 0 5.3 225 1.537e+6 12||12 >sp|Q58DT5|ELMD3 BOVIN ELMO domain-contain...1.78 1.78 274.1 1 1 0 2.1 381 3.453e+4 113|13 >tr|F1MDS0IF1MDS0 BOVIN Proteoglycan 4 OS=B... 1.63 1.63 261.4 1 1 0 0.7 1195 7.079e+3 图8 牛蛋白组匹配结果 (Byonic) 结论 本文采用自下而上(Bottom-up)的研究策略，对 BSA 进行了鉴定研究。BSA 样品经 LCMS-9030分析，经两种软件计算， PSM 匹配得分均大于80%，即使是在复杂蛋白组成体系中，PSM 也能获得68%或以上的匹配结果。同时，对 BSA翻译后修饰进行了研究，除固定修饰乙酰胺化外， BSA仅存在少量的N-脱酰胺(Deamidated)等可变修饰，可变修饰比例低于3%。该方法简便，准确，适合蛋白组学或蛋白类药物的鉴别研究。 岛津应用云 本文采用自下而上(Bottom-up)的研究策略，对BSA进行了鉴定研究。BSA样品经LCMS-9030分析，经两种软件计算，PSM匹配得分均大于80%，即使是在复杂蛋白组成体系中，PSM也能获得68%或以上的匹配结果。同时，对BSA翻译后修饰进行了研究，除固定修饰乙酰胺化外，BSA仅存在少量的N-脱酰胺（Deamidated）等可变修饰，可变修饰比例低于3%。该方法简便，准确，适合蛋白组学或蛋白类药物的鉴别研究。