稻米中脂肪含量检测方案(近红外光谱仪)

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稻米脂肪含量近红外光谱分析技术研究 王海莲1 ，万向元 1 ，胡培松 2 ，翟虎渠 3 ，万建民 1 ,3 （ 1 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，南京 210095； 2 中国水稻研究所， 杭州 310006；3 中国农业科学院，北京 100081） 摘要：应用近红外光谱（NIRS）分析技术和偏最小二乘法（PLS）建立稻米脂肪定量分析数学模型，并比较糙米粒和糙米粉 NIRS 数学模型对预测稻米脂肪含量的效果差异。结果表明，当利用糙米粒和糙米粉 NIRS 数学模型对样品进行预测时，内部交叉验证预测值和真值之间的决定系数（ R2 ）分别为 94.44%和 95.54%，内部交叉检验的标准差（RMSECV）分别为 0.09%和 0.08%；外部验证预测值和真值之间的 R2 值分别为 79.51%和 87.10%，预测标准差（RMSEP）分别为 0.24%和 0.26%，平均相对误差（ARE）分别为 4.11%和 3.30%。内部交叉验证和外部验证结果证明，糙米粒和糙米粉 NIRS 数学模型均具有较高的预测准确性，可应用于稻米营养品质改良实践。 关键词：稻米；脂肪含量；近红外光谱（NIRS）；定量分析 脂肪是稻米重要的营养物质之一，其含量的高低对稻米食味、营养以及外观品质均有较大的影响 [1~5] 。建立高效、准确的脂肪含量分析方法，不仅对水稻种质资源的快速筛选及其有效育种利用有重要意义，而且能为深入研究稻米脂肪含量的遗传机理和脂类代谢的生理生化机制提供技术保障。然而，目前常规测定脂肪含量都是用索氏抽提法，该方法因“速度慢、重演性低、易造成环境污染、样品需破碎和损耗”等缺点，限制了在稻米品质改良研究中的广泛应用。近红外光谱（NIRS）技术是 20 世纪 80 年代后期迅速发展起来的一项物理测试技术，有样品不需预处理、无损耗、光谱扫描速度快、多成分同时分析、分析过程无污染、分析结果重演性高等优点，已成为谷物品质分析的重要手段。目前，国内外已构建了许多预测直链淀粉含量、蛋白质含量、氨基酸含量等稻米品质指标的 NIRS 数学模型，并取得了较好的分析结果 [6~10] ，但是尚未见糙米脂肪含量预测模型的报道。鉴此，本研究建立了稻米脂肪含量近红外预测模型，并比较了糙米粒和糙米粉模型的预测效果差异，期望为稻米营养品质改良研究提供一套高效、准确的脂肪含量分析方法。 1 材料与方法 1.1 试验材料与样品制备 共利用 159 份不同的水稻品种，其中58 份于 2002年种植在海南陵水县试验基地，另外 101 份于 2003年种植在中国水稻研究所试验基地。在 159 份供试材料中籼稻 114 份，粳稻 38 份，糯稻 7 份。水稻成熟时收获，取 100 g 稻谷，用糙米机脱壳。取 25 g 糙米磨成糙米粉，过 100 目筛，再从中取 5 g用于脂肪含量化学分析，剩余的糙米粉和糙米粒用于近红外光谱采集。 1.2 脂肪含量的化学测定 稻米脂肪含量的测定采用 Tecator 索氏抽提法，利用 FOSS 公司 SOXTEC 高温系统 HT6 仪器，以石油醚为溶剂，在 100℃浸泡 1 h，沸腾抽提 3 h。 1.3 近红外光谱采集 利用德国 BRUKER 公司生产的 VERCTOR22/N型傅立叶变换近红外光谱仪采集待测样品的近红外吸收光谱。扫描谱区为 3 900～12 000 cm -1 ，扫描次数为64 次，光谱分辨率为 8 cm -1 。测量前对仪器进行预热，IT（instrument test）通过后，进行样品的扫描，测量过程中每隔 30 min 进行背景扫描，保证测量环境和人工操作的一致性。每个样品重复扫描 3 次，用配套软件中的 AVERAGE 命令对光谱图进行平均处理。 1.4 模型建立与优劣判别 依据偏最小二乘法（PLS）原理，利用 OPUS 定量分析软件中 QUANT2 程序进行模型构建。首先，将待测样品集的化学值与相应的光谱值输入到建模程序QUANT2 中，再利用 Optimize 程序自动优化处理，选择最佳建模条件，包括最佳光谱预处理方法、最佳谱区、最佳主成分维数等。所建模型的优劣采用内部交叉验证和外部验证评价，如决定系数（R 2 ）、标准差、平均相对误差等，预测模型决定系数越大，标准差和相对误差越小，模型质量越好；反之亦然。 2 结果与分析 2.1 脂肪含量化学值的分析 159 份样品糙米脂肪含量的分布如图 1 所示，可见 87%样品的脂肪含量在 1.9%～2.9%之间，两个极端的样品比较少。样品的含量范围基本覆盖当前水稻品种的脂肪含量，在脂肪含量上具有一定的代表性。所测样品糙米脂肪含量化学值测定的基本参数如表 1 所示。 图 1 糙米脂肪含量分布 Fig.1 The distribution of fat content in brown rice 表 1 糙米脂肪含量化学值测定的基本参数 Table 1 Basic parameters of chemical analysis for fat contentin brown rice 2.2 糙米粒和糙米粉的近红外吸收光谱图 脂肪在近红外光谱区（3 900～12 000 cm -1 ）的吸收光谱大部分是氢与其它离子或基团（如O-H和C-H）伸缩振动能级跃迁所引起的倍频和合频。在该谱区内含氢基团的吸收频率特别强，同时又比较稳定。所以利用近红外光谱技术比较适合分析水稻脂肪含量。同一份糙米粒和糙米粉样品 3 次扫描的近红外吸收光谱如图 2-a,b 所示；建模样品集糙米粒和糙米粉的近红外吸收光谱如图 2-c,d 所示。可见，糙米粒和糙米粉在近红外光谱区（3 900～12 000 cm -1 ）均有明显的吸收峰，且吸收光谱特征基本一致。由于脂肪是复杂的有机分子，其倍频和合频是各种振动互相影响的结果 [11] ，其频带极宽；另一方面稻米主要有淀粉，蛋白质等其它成分构成，脂肪含量仅占 2%～3%，所以显著影响脂肪吸收特征的官能团也存在与其它成分中。频带加宽和官能团的交叉使各成分在近红外谱区的吸收光谱重叠。同时，由于不同的样品化学组分不完全相同，所以样品集的光谱也不完全重合。 a 和 c 分别为糙米粒 3 个重复和样品集的光谱图；b 和 d 分别为糙米粉 3 个重复和样集的光谱图 a and c represent the near-infrared spectra of three repetitions and total samples of brown rice grain, respectively; b and d represent the near-infrared spectra of three repetitions and total samples of brown rice flour, respectively 图 2 糙米和糙米粉近红外吸收光谱图 Fig. 2 Near-infrared spectra of brown rice grain and brown rice flour 2.3 模型的建立与优化 将糙米粒和糙米粉样品各分两组，一组是校正集 样品，共 138 份，用来构建稻米脂肪含量近红外模型；另一组为检验集样品，共 21 份，用以检验所建模型的预测效果。利用 OPUS 软件中的自动优化程序处理获 得的最佳建模条件如表 2 所示。因为在样品化学值测定和近红外光谱采集过程中 都存在误差，故在模型优化时设置检验异常阈值为0.99，经 F 测验，剔除误差大于平均误差的样品，结果实际建模样品集分别为 104 份（糙米粒）和 107 份（糙米粉），由此建立的糙米脂肪含量近红外模型具有较高预测准确性。内部交叉证实预测值和化学方法 测定值（真值）之间的决定系数（R 2 ）分别为 94.44%和 95.54%，内部交叉检验的标准差（RMSECV）分别为 0.09%和 0.08%（表 3）；脂肪含量近红外模型预测值与真值之间存在很好的线性关系，相关性达到极显著水平（图 3）。 表 2 建立近红外预测模型的最佳条件 Table 2 The optimal conditions for establishing NIR predicted models 表 3 糙米脂肪含量校正集统计参数 Table 3 Calibration statistics for fat content in brown rice 图 3 建模集糙米粉和糙米粒脂肪含量化学测定值和预测值之间的相关性 Fig. 3 Correlation between predicted value and true value of modeling set of fat content in brown rice grain and brown rice flour 2.4 数学模型的可靠性评价 利用外部验证的方法评价所建模型的可靠性，即选择一批与建模样品集独立无关的样品即检验集样品，通过比较检验集样品预测值与化学值的差异来判断模型的预测准确性。21 份检验集样品的模型外部验证结果列入表 4、5 和图 4。可见，糙米粒模型的 R 2 值为 79.51%，RMSEP 值为 0.24%，平均相对误差为4.11%；糙米粉模型的 R 2 值为 87.10%，RMSEP 为0.26%，平均相对误差为 3.29%。上述内部交叉验证和外部验证结果证明利用糙米粉和糙米粒所建预测模型的决定系数均较高，预测标准差和平均相对误差均较小，因此它们均可应用于稻米营养品质改良实践；相对而言，糙米粉所建模型的预测准确性比糙米粒模型的预测准确性稍高。 表 4 脂肪含量检验集统计参数 Table 4 External validation statistics for fat content 表 5 检验集样品脂肪含量的真值、预测值、绝对误差和相对误差 Table 5 The true value, predicted value, absolute error and relative error of fat of brown rice samples in prediction set 1) 模型 1 代表用糙米粉扫描光谱所建模型； 2) 模型 2 代表用糙米粒扫描光谱所建模型 1) Model 1. Model established by brown rice flour: 2) Model 2. Model established by brown rice grain 图 4 检验集糙米粉和糙米粒脂肪含量真值和预测之间的相关性 Fig. 4 The correlation between predicted value and true value of testing set of fat content in brown rice grain and brown rice flour 3 讨论 脂肪是稻米营养品质的主要组成成分，虽然含量较低，但是对稻米的食味品质和外观品质都有较大的影响。在稻米品质改良中，育种家也意识到脂肪在稻米品质改良中所起的作用，吴长明 [2] 认为北方粳米应把适当降低蛋白质含量、提高粗脂肪含量作为全面改善稻米品质的重要手段；在早籼稻品质改良中应重视适当降低蛋白质含量和提高粗脂肪含量在改善早籼稻品质的重要作用。祁祖白 [1] 报道脂肪含量是受多基因控制的数量性状，遗传力较大。经过多代选择易得到高脂肪含量且性状稳定的优良品种。陈建国 [12] 研究表明籼粳亚种间杂交组合中，脂肪含量的表达主要受控于种子直接加性效应和母体加性效应。上述研究中，对脂肪含量的分析方法都是采用传统的分析方法-索氏抽提法，该方法分析 1 批样品需要 8 h 以上时间，即使是改进后的索氏抽提仪，抽提一批样品也需要2～3 h。对于测定少量的样品脂肪含量，一般用索氏抽提法是可以完成的。随着 DNA 分子标记的发展及饱和分子连锁图谱的建立，对控制某一性状的基因进行定位成为可能。定位群体一般都上百株，对于易受环境影响的数量性状，为了得到稳定表达的 QTL，必须进行多个地点多个年份的实验。用索氏抽提法测定定位群体，需要消耗大量的人力和物力。所以目前仅有几例稻米含量 QTL 定位的报道 [4,5,13,14] 。对于更深入的研究，既对控制脂肪含量的 QTL 进行精细定位将会 更加困难，精细定位群体一般几千株到上万株，如此大的工作量，是传统方法在一定的时间内无法完成的。这可能是未见对稻米脂肪含量进行更深入研究的重要原因之一。在脂肪测定方面，近红外技术主要应用在大豆 [15]油菜 [16] 等含油量比较高的作物上，而测定糙米中的脂肪含量的研究报道还未见有报道。本研究建立的糙米粒和糙米粉近红外预测模型均具很高的内部交叉证实和外部验证决定系数（R 2 ≥80%），而内部交叉证实标准差和外部验证预测标准差却很低（SE≤0.26%），平均相对误差也较低（ARE≤4.11%），接近常规分析误差。本试验的不足之处是所收集的样品主要是籼稻品种，不能代表整个育种领域的水稻品种，至使所建的模型具有一定的局限性。本研究是对近红外技术预测稻米脂肪含量的一个尝试，在以后的研究中我们应当扩大收集材料的范围，使粳稻、籼稻和糯稻的数量在建模时达到均衡；同时分别建立粳稻、籼稻和糯稻的脂肪含量预测模型，达到更精确和准确的测定水稻中的脂肪含量。但是本文建立的两个近红外预测模型具有较高的可靠性，可替代传统的脂肪含量测定方法，在稻米脂肪含量遗传理论研究和营养品质改良实践中应用。相类似，Kawamura 等 [17] 建立了稻米水分和蛋白质含量的近红外预测模型，并利用其分析了大量水稻资源糙米和精米的含水量和蛋白质含量，对不同材料进行稻米品质等级分划；Kianian 等 [18] 利用去壳燕麦脂肪含量近红外预测模型和两个重组自交系群体，初步定位控制燕麦脂肪含量的 QTL，并取得较理想的结果。利用传统的测定方法分析 1 批样品脂肪含量需要8 个多小时，而利用本研究建立的近红外预测模型分析 1 份样品仅需 1 min，极大地提高了脂肪含量表型鉴定的效率，打破了以往因脂肪含量测定方法复杂性限制稻米脂肪遗传机理和脂类代谢生理生化途径快速、深入研究的瓶颈。目前，脂肪含量预测模型在水稻研究上有 3 方面的应用潜力：（1）对数万份水稻突变体进行快速筛选，期望在短时间内获得高脂肪含量材料，相关领域功能基因组学和代谢组学研究提供宝贵资源；（2）分析不同遗传群体在“多年多点”的稻米脂肪含量，有望获得相关稳定表达的 QTL，为稻米营养品质分子设计育种提供可利用分子标记；（3）对水稻野生种质和育种后代进行脂肪含量快速鉴定，可拓宽营养品质改良的有利资源和提高育种效率。此外，本研究在建模样品集相同的情况下，糙米粉模型的预测准确性比糙米粒的稍高，因此根据不同的研究目的，可选择利用不同的预测模型，例如在育 种实践中，有些珍贵的材料要求在品质分析后仍能保持子粒完好无损以备继续繁殖，此时可选用糙米粒模型；但对于那些样品量较多的材料，为了获得更准确的分析结果，用糙米粉模型较好。 4 结论 本试验应用近红外光谱（NIRS）分析技术和偏最小二乘法（PLS）建立了稻米脂肪定量分析数学模型。内部交叉验证预测值和真值之间的决定系数（R 2 ）分别为 94.44%和 95.54%，相应的标准差（RMSECV）分别为 0.09%和 0.08%；外部验证预测值和真值之间的 R 2 值分别为 79.51%和 87.10%，标准差（RMSEP）分别为 0.24%和 0.26%。说明糙米粒和糙米粉 NIRS 数学模型均具有较高的预测准确性，可应用于稻米营养品质改良实践。同时对不同样品形态所建立的数学模型的效果进行了比较。在建模样品集样品相同的情况下，糙米粉模型的预测准确性比糙米粒的稍高。所以在实际应用近红外技术时，可以根据不同的研究目 的，选择利用不同的预测模型。 References [1] 祁祖白, 李宝健, 杨文广, 吴秀峰. 水稻籽粒外观品质及脂肪含量的遗传分析.遗传学报，1983, 10(6): 452-458. 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