双抗中分子量检测方案(液相色谱仪)

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SSL-CA22-207Excellence in Science Excellence in ScienceLC-305 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.- Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn 生物兼容液相色谱仪与多角度光散射检测器联用测定双抗分子量 LC-305 摘要：本文采用岛津生物兼容液相色谱仪 Nexera Bio 联合多角度光散射检测器测定双抗分子量，为推断双抗连接情况提供依据。本实验采用体积排阻色谱对双抗样品进行分离，多角度光散射检测器检测分子量。通过谱图得知，此双抗样品(单抗Fc端融合型)含3个主要成分，多角度光散射检测器测得重均分子量分别为197708 Da、145121 Da、56401 Da，推测双抗样品组成为双抗 (Fc端融合scFv)，，单抗(未融合scFv)和单链抗体 scFv。此分子量测定方法操作简便，快速，成本低，可为双抗连接情况的确定提供依据。 关键词：多角度光散射检测器 双抗重均分子量 邓特异性抗体(以下简称双抗)是同时能够结合两个不同表位或者抗原的抗体，从而阻断或激活双靶点信号通路，介导免疫细胞对肿瘤细胞更好的杀伤，因此可能会获得比单一抗体更好的临床结果，双抗研发也备受关注。 区域的双抗药物，血浆半衰期期长，i， 可发挥类似于 IgG的抗体特点。 双抗种类繁多，有基于片段化设计的分子，直接将多个抗原结合单元结合在一个没有 Fc 区域的分子上，设计简单，但缺乏Fc端，血浆半衰期相对较短，可能存在稳定性和聚集性问题；也有基于保留Fc区域设计的对称性分子设计和非对称性分子设计模式，保留Fc 在双抗产品研发生产过程中，需要对其大小异质性进行分析，反映双抗连接情况，保障产品质量。本文采用体积排阻色谱 (SEC) 联合多角度光散射检测器(MALS) 对单抗 Fc 端融合型对称分子双抗样品大小异质性进行分析， SEC 根据分子量大小分离双抗样品，MALS 检测器测定双抗样品分子量，从而推断双抗样品连接情况。此方法简单高效、准确度高，，可用于测定双抗样品分子量。 实验部分 1.1仪器 本实验采用岛津生物兼容液相色谱系统((Nexera Bio)。具体配置为： 系统控制器：CBM-20A脱气机： DGU-20As输液泵： LC-20ADyp自动进样器： SIL-20Ay柱温箱：CTO-20AC检测器1： SPD-M20A色谱工作站：LabSolutions Ver. 5.98检测器2： MALS* MALS*：多角度光散射检测器 1.2分析条件 色谱柱： SHIMSEN Ankylo SEC-300 (300 mm ×7.8 mml.D.，3.0 um) 岛津(上海)实验器材有限公司，P/N： 380-01215-10 流动相：A相：50mM 磷酸盐缓冲液+300 mM NaCl (pH=6.8) B相：乙腈 流速：0.7 mL/min柱温：30℃进样体积：10uL检测波长：260nm 洗脱方式：等度洗脱，B相浓度为10%。 标准溶液和样品配制方法 牛血清蛋白(BSA)标准溶液：称取牛血清蛋白2.000 mg，用超纯水定容至1mL， 浓度为2.000 mg/mL。双抗溶液：双抗样品用超纯水溶解，浓度为 5.000 mg/mL。 结果与讨论 3.1 MALS 测定分子质量原理 当分子被激光照射时，散射光的强度与其分子量有直接相关，这种关系可以用光散射 Rayleigh 方程来进行描述。当从10°角(小角度)来测量低浓度样品光散射强度时， Rayleigh 方程可以简化为： RLALS=KoptXc×Mw.其中， RLALS 为小角度散射光强，可由 MALS检测器检测得到； kopt为光散射常数；c为浓度，单位为 mg/mL；Mw 为重均分子量。 如需得到分子量分布，还需浓度型检测器计算不同分子量的占比，所以本文将紫外检测器与 MALS 连用，得到不同分子量占比，计算数均分子量Mn、Z均分子量Mz 及分子量分布指数。 MALS 测定分子量还需计算仪器响应常数，一般采用已知分子量的同类型标准溶液计算得到，本实验标准溶液为牛血清蛋白溶液。 3.2牛血清蛋白标准溶液谱图 分析牛血清蛋白标准溶液，已知分子量为66500，得到谱图如图1所示。从图可知，紫外谱图有3个峰，保留时间12.950 min 的主峰为 BSA 主成分， 10-12 min 两峰为聚集体。通过 SECview 软件计算得到主成分含量为86.29%，主成分浓度为 1.726 mg/mL， MALS仪器响应强度为2.9626×10，紫外仪器响应强度为8.8552×10。 图1 EBSA 溶液谱图 3.3双抗样品分子量结果 按照1.2中仪器方法分析双抗样品，该样品为单抗 Fc 端融合型双抗，得到谱图如图2所示。从图中可见：双抗样品共出现3个主要色谱峰，通过 SECview 软件计算得到峰1、峰2、峰3重均分子量 Mw 分别为197708Da、145121 Da、56401Da，三峰重均分子量与数均分子量的比值(Mw/Mn)均为1.00，具体分子量分布见图3. 峰2与峰3分子量之和为201522 Da， 与峰1分子量偏差为1.92%，故推测峰1为双抗(单抗Fc端融合scFv)，峰2为单抗(未融合scFv)， 峰3为单链抗体 scFv. Time (min) 图2 双抗样品谱图 Peak Left Limit [Min] Right Limit [Min] Retention time [Min] MW by LS[Da] Mn by LS[Da] Mw by LS [Da] Mz by LS[Da] Mp by LS[Da] Number Peak 1 10.699 11.538| 11.046| 194，882 197.453 197，708| 197.951| 173，569| Peak 2 11.514 12.912| 11.962 145.151 144.757 145.121 145，464| 133.651 Peak 3 13.308 14.101| 13.641| 55，999| 56，193| 56，401| 56.599 48，083| 图3 双抗样品分子量分布 结论 本文采用岛津生物兼容液相色谱仪 Nexera Bio 联合多角度光散射检测器测定双抗分子量，为推断双抗连接情况提供依据。本实验采用体积排阻色谱对双抗样品进行分离，多角度光散射检测器检测分子量。通过谱图得知，此双抗样品(单抗Fc 端融合型)含3个主要成分，多角度光散射检测器测得重均分子量分别为197708Da、145121 Da、56401 Da，推测双抗样品组成为双抗 (Fc端融合scFv)，单抗(未融合scFv)和单链抗体scFv。 此分子量测定方法操作简便，快速，成本低，可为双抗连接情况的确定提供依据。 岛津应用云 本文采用岛津生物兼容液相色谱仪Nexera Bio联合多角度光散射检测器测定双抗分子量，为推断双抗连接情况提供依据。本实验采用体积排阻色谱对双抗样品进行分离，多角度光散射检测器检测分子量。通过谱图得知，此双抗样品（单抗Fc端融合型）含3个主要成分，多角度光散射检测器测得重均分子量分别为197708 Da、145121 Da、56401 Da，推测双抗样品组成为双抗（Fc端融合scFv），单抗（未融合scFv）和单链抗体scFv。此分子量测定方法操作简便，快速，成本低，可为双抗连接情况的确定提供依据。