活细胞中分析检测方案(高内涵成像)

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SARTORIUS 在免疫学中的应用 关键词或短语： 免疫学、活细胞分析、免疫分型， NETosis， 吞吞噬作用，免疫细胞杀伤，抗体内化，巨噬细胞，T细胞 活细胞分析在免疫学中的十大应用 Del Trezise Essen BioScience Ltd.， a Sartorius Company， Welwyn Garden City AL7 3AX UK 引言 免疫细胞体外分析的主要方法包括流式细胞术、PCR以及各种形式的 ELISA (如 ELISPOT)。这些技术加在一起，可以从分子水平上对不同的细胞群的功能进行检测，并对免疫反应进行量化，例如，细胞因子的释放。虽然这些平台非常强大，但它们对细胞的形态和相互作用的解析还不够深入。此外，作为“终点法”方法，它们无法完整地反映出细胞随时间的变化情况。 近年来，实时活细胞分析已成为免疫学研究重要的研究方法，突破了传统方法的诸多限制。在这里，我们总结了10个活细胞分析技术在免疫学中的重要应用，阐述这种方法的广度、深度和价值。 什么是活细胞分析? 活细胞分析是利用延时成像(数小时至数周)对活细胞的行为进行实时量化。 该技术包括： 随着时间推移，反复获取同一细胞的图像 2.在整个实验过程中将细胞维持在不受干扰的稳定的生理环境中 3.进行即时的图像分析和数据可视化，提供实时动态的细胞生理学变化(图1) 赛多利斯推出专业的业细胞分析系统Incucyte@，可以自动收集、分析和展示2000多个平行实验(如6x384孔微孔板)的图像和长时间监测数据。Incucyte@的独特之处在于：能够直接置于标准细胞培养箱内，光学检测系统会移动(而不是细胞板)，这样就可以在不干扰细胞的情况下捕捉非贴壁细胞的高质量图像。另外，搭配优化的活细胞试剂、实验方案和软件，提供一套“综合解决方案”，可作为“实验日常必备工具”。 图1：工作流程、质量控制和细胞健康。连续活细胞分析和终点法工作流程的比较。对于活细胞分析，图像和数据是在细胞培养箱内，在整个培养、操作和动力学检测阶段实时收集的。 在最近的发展中，可以使用新的图像分割工具 (Incucyte@Cell-by-Cell Analysis) 进行非标记细胞计数。通过面积尺寸和形状(偏心度)等指标在单个细胞水平上对视野中的所有细胞进行计算，并使用类似于流式细胞仪中使用的“散点图”工具显示。这种强大的技术能够进行精确地细胞计数，并对细胞群中单个细胞的参数更深入地了解。无论采用哪种方法，都能产生完整的时间过程数据、洞察有价值的细胞形态，并能够使用96或 384孔板进行“微量化”检测，并满足工业开发所需的通量。 2.细胞鉴定和免疫分型 荧光标记的 CD 抗体(Abs)被广泛用于流式细胞仪，用于细胞识别和免疫分型。基于这些特征，至少有15种人类T细胞亚型被描述出来：((例如， CD4+，CD8+，等等)。现在已经开发了使用相同原理的活细胞分析方法。与其使用直接标记的 Abs， 不如将抗 CD 的 Abs 结合到同型匹配的带有荧光标签的 Fc 区域靶向 Fab 片段(如 Incucyte@Fabfluor-488 Dye)，这可以通过简单的一步混合来完成。 Time (h) 图2：细胞增殖的评估。图片显示了 Ramos B细胞培养板中生长24小时和72小时后，分别使用汇合度 masking 和 Incucyte@Cell-by-Cell分析软件模块的分析图像。用这两种分析方法拟合出类似生长曲线的时间过程曲线如右图所示。 在检测中使用一种非干扰性的背景荧光抑制染料， I以帮助改善488 nM 的荧光信号。然后将 Fabfluor-488 标记的 Ab和抑制剂直接加入至细胞中，只有表达表面标志物的细胞才会发出荧光。然后，细胞亚群可以很容易地被识别并随着时间的推移被量化。 在最简单的免疫表型应用中，可以确定标记物阳性细胞(如CD4+、CD8+)的百分比，并将形态学属性与不同的亚群联系起来，并且测量细胞占比随时间的变化。更有用的是能够观察培养物中细胞亚群之间的相互作用--例如，在基于 PBMC的免疫细胞杀伤实验中， CD8+细胞毒性T细胞与肿瘤目标的物理相互作用可以被可视化(第5节)。 3.细胞激活和分化 免疫细胞的分化和激活是免疫力和免疫应答的关键步骤。细胞通过受体信号传导进行扩增并产生功能效应，最终导致基因表达、分化和表型变化。活细胞分析很适合研究其 复杂性和动态性。在一个简单的案例中，我们评估了化合剂诱导的人类中性粒细胞的激活(图3)。图像分割工具Cell-by-cell analysis 表明了在对 CXCL8的反应中，面积、形状(偏心度)和CD11b(整合素aM， C3 受体的一部分，用Fabfluor-488/Ab复合物进行定量)的时间和浓度依赖性的变化。这些变化的时间过程相似(0-6小时)，偏心度和 CD11b 表达增加的 ECso 值分别为 0.63nM 和 0.22nM。CXCL8 诱导的激活被抗 CXCL8抗体减弱了。 在进一步分析中，我们检测了刺激诱导人 THP-1单核细胞向巨噬细胞的分化。对照组(未处理)和受刺激的THP-1细胞中，随处可见的细胞表面标面物 CD45 在三天的监测过程中没有任何的变化。 CD45可被认为是一个稳定的"管家"蛋白。在控制条件下， THP-1细胞在长达72小时内几乎没有表达 CD11b、CD14(一种内毒素受体)和CD40(一种共刺激蛋白)。 在12-72小时内，这三种 CD 标志物的表达都可以在特定的分化剂，如维生素D3、IFN y+mCSF、IFN y+LPS、醋酸山梨醇(PMA)的作用下被不同程度地上调。最明显的是，PMA 上调了 CD11b和 CD40，但没有上调CD14，而维生素D3以时间依赖的方式增加了 CD11b 和 CD14的表达(图4)。维生素 D3没有上调CD40。仔细观察细胞图像，只有 PMA 使细胞形态产生了明显的变化，产生了大的、扁平的、粘附的"巨噬细胞"样细胞。只有那些用 PMA 处理的细胞能够吞噬pHrodo标记的凋亡 Jurkat 细胞(第6节)。 这些数据共同说明了如何使用 Incucyte@一种检测工具来同时检测表面蛋白标志物、细胞形态和功能随时间的变化，并突出了对个别分化刺激的特征性反应。 上述应用也可以通过使用专为活细胞分析而优化的荧光染料，与细胞凋亡或细胞健康读数进行关联。例如，细胞凋亡可以通过磷脂酰丝氨酸外翻 (Incucyte@ Annexin V Dye)和Caspase 3/7 活性进行测量 (Incucyte@ Caspase 3/7 Dye；Zhang， et al.， 1997； Cen， et al.， 2008； Daya， et al.，2010)。细胞非通透性的 DNA 结合荧光探针(如 Incucyte@ CytotoxRed Dye)可用于检测细胞膜的完整性。活细胞分析的实时读数提供了对细胞凋亡、细胞死亡的时间过程以及它们与细胞增殖的关系的洞察(Artymovich 和 Appledorn，2014). 图4：多种细胞表面标志物、吞噬活性和增殖的检测，加上形态学的可视化来研究分化。THP-1单核细胞在 Incucyte@ Fabfluor-488 染料与 CD11b、CD14 或 CD40 复合的情况下暴露于培养基(未分化)、维生素 D3 或 PMA。 与单独的培养基或维生素 D3 处理的细胞相比， PMA显示了细胞形态的明显变化(高清相差图像)。动力图突出了各种处理条件下不同的、随时间变化的表面蛋白表达。有趣的是， PMA，而不是培养基或维生素 D3， 产生了细胞增殖(汇合)的减少和吞噬潜力的增加，这是通过用 pHrodo红细胞标记试剂盒标记的凋亡 Jurkat 的胞葬作用衡量的。 5.免疫细胞杀伤(细胞溶解) 细胞毒性T淋巴细胞 (CTLs)、自然杀伤细胞(NK) 和某些中性粒细胞能够杀死被感染的或恶性细胞。虽然杀伤机制可能不同(例如，释放细胞因子、细胞毒性颗粒或 ROS、Fas/FasL相互作用)，但最终这些免疫防御者通过细胞裂解使不需要的细胞失活。细胞溶解实验通常涉及检测垂死靶细胞中释放的预标记物(如Cr51)或细胞酶(如LDH)等如果涉及到细胞凋亡机制，，可以采用 annexin V 或 caspase3/7激活的生物化学检测方法。其中关键的挑战是：(1)高背景信号；(2)难以辨别可能来自效应(杀伤)细胞的污染信号；(3)如何判定并测量杀伤终点。 活细胞分析提供了许多测量细胞溶解的方法。最简单的是，可以用荧光蛋白(如RFP)标记目标细胞，当它们被裂解时，监测其红色荧光的损失。例如，THP-1细胞被核靶向 RFP稳定转染后转移至96孔板上。加入预激活的 PBMCs(抗CD3/IL-2，72小时)，引起 THP-1细胞快速且随时间变化的裂解，最终完全失去 RFP 信号。细胞溶解的速度取决于PBMCs的数量(比例为1：1至1：10)。细胞溶解信号通过检查细胞图像得到验证，显示膜破坏、运动能力丧失和目标 细胞的收缩。类似的检测原理可以应用于肿瘤球的杀伤。在图5中， Incucyte@ Nuclight Red A549 肿瘤细胞在加入PBMCs之前，在超低吸附板(ULA)中形成并生长3天形成3D 球细胞模型。随着时间的推移， PBMCs 裂解了球状体并消除了红色荧光信号。 这种形式可以扩展到在第二荧光通道中直接测量目标细胞的凋亡(McCormack，et al.，2013)。只要效应细胞比目标细胞小，任何来自PBMCs 的凋亡信号都可以通过荧光对象的尺寸门控来排除。为了说明这一点， CD8+细胞毒性T细胞与 Incucyte@ Nuclight Red A549 细胞在 Incucyte@Caspase 3/7染料(5mM)存在下共同培养在96孔板上。通过加入抗 CD3/IL-2，在共培养物内激活T细胞，使其死亡。在此应用案例中，T细胞杀伤开始大约需要48小时，同时观察到凋亡细胞核(绿色Caspase 3/7标记)的上升和红细胞数量的下降(细胞溶解)，验证了凋亡介导的细胞死亡。 这些方法对于表征检查点抑制剂、CAR-T细胞、双特异性抗体和其他基于免疫的疗法的表型效应非常有用。 192 Day 0 Day 4 Day 7 Time After PBMC Addition (h) 图5：活化的PBMCs 对肿瘤球增殖的影响。将稳定表达Incucyte° Nuclight Red 慢病毒的A549肿瘤细胞接种在圆底ULA 96 孔板中(2500个细胞/孔)，培养三天形成球体，接着在有或没有抗 CD3 和IL-2抗体的混合物(各10ng/mL)中，与新鲜分离的 PBMCs (E： T， 2.5： 1)共同培养。Incucyte@HD 相位和荧光图像比较了在没有(非激活，上图)和有(激活，下图) Anti-CD3 和IL-2抗体的情况下 PBMCs 对球状细胞增殖的影响。注意在有激活的PBMCs的情况下，肿瘤球的荧光强度明显下降。时间进程曲线显示球体的细胞毒性被量化为随时间变化的荧光强度损失。每间隔6小时收集一次数据，持续7天。每个数据点代表平均值±SEM， n=3 wells。 6.吞噬作用和细胞清除 吞噬作用是一种特殊形式的细胞内吞作用，通过这种作用，微生物(如微生物病原体)和外来的、垂死的细胞被灭活并从体内清除。免疫系统的专业吞噬细胞胞括巨噬细胞、中性粒细胞、Kuppfer细胞、小胶质细胞和未成熟的树突状细胞。吞噬作用的检测通常需要在微生物或细胞被内化时，通过检测其荧光标签来进行。其中非常重要的是要区分吞噬作用和非特异性的细胞吸收或表面结合的非内化标签。Incucyte@已经开发了使用 pH值敏感染料(如pHrodo@)标记活细胞分析方法，该标签与细菌壁蛋白或目标细胞连接。当蛋白或目标细胞被吞噬并进入吞噬体的酸性环境时，可以测量染料荧光随时间的增强。 在第一个例子中，通过加入 pHrodo@绿色标记的大肠杆菌生物颗粒，测量小鼠J774.1巨噬细胞对大肠杆菌的吞噬作用。 细胞内的荧光随着时间的推移(24小时)而增加，因为生物颗粒被内化了(图6)。在对照实验中，如果没有生物颗粒或使用非吞噬细胞(如A549)，则观察不到荧光(数据未显示)。细胞吞噬作用的抑制剂，包括细胞松弛素D和乳清蛋白A，可以消除这种信号。此外，， F可以清楚地观察到通过在细胞膜上形成的吞噬杯对生物颗粒的吞噬。 为了说明哺乳动物细胞的吞噬作用("胞葬作用")，我们描述了抗 CD47 抗体介导的小鼠骨髓巨噬细胞对CD47+CCRF-CEMT淋巴细胞的吞噬。 CD47 是一种跨膜的"don’t-eat-me"信号蛋白，能使肿瘤细胞逃避邻近吞噬细胞的清除。阻断 CD47可使吞噬细胞识别并清除肿瘤细胞，是一种有希望的免疫治疗新方法。抗 CD47 抗体(0.04-5mgmL)，而非IgG-对照，对 CCRF-CEMs 产生时间和浓度依赖性的吞噬(30分钟-6小时，图6C)。 凋亡的 CCRF-CEM细胞(喜树碱，10mM) 也被吞噬。在这两种情况下，信号窗口都很大，而且吞噬可以通过可视化来验证。这种功能验证分析可用于筛选新的 CD47 调节剂和细胞吞噬作用的调节剂。 分析的最佳时间点，如 NETs 中细胞外骨髓氧化酶(MPO)的存在。 Gupta 总结说，活细胞分析是"评估中性粒细胞生理学和NETosis，以及迅速开发和测试新的中性粒细胞靶标的有力工具"。 7.NETosis 8.趋化作用 NETosis 是一种独特的细胞程序性死亡的形式，也是机体防御感染的机制之一。当中性粒细胞遇到入侵的病原体时，它们会释放出一种抗菌蛋白和染色质的混合物来捕获和降解微生物。活细胞分析可以通过使用荧光 DNA 结合试剂实时自动地可视化和量化这些胞外陷阱，或NETs (Gupta， etal.，2017)。 当使用 NETosis 诱导刺激物(如PMA、IONOMYCIN)处理中性粒细胞时，荧光强度迅速上升，细胞边界会显示降解的 DNA云或光晕(图7)。可以观察到细胞核的退化和细胞运动能力的丧失。将此分析结果与磷脂酰丝氨酸(PS)外翻， 以及活性氧(ROS)检测进行关联，可以阐明NETosis 的不同机制。实时数据分析也有助于确定补充生化 趋化作用是细胞在化学刺激下的定向运动，是免疫反应的一个重要组成部分。中性粒细胞、单核细胞、T细胞、巨噬细胞和小胶质细胞都会以这种方式被吸引到病原体和炎症刺激物上。使用专门的 Incucyte@ Clearview 96 孔趋化板 (e.g.，Taylor， et al.， 2016； He， et al.， 2018)，可以通过活细胞分析检测趋化作用。新型的 transwell 在每个孔中都有精确的激光钻孔供细胞移动通过。与传统的 Boyden chamber实验不同的是，当细胞向化学试剂移动时，可以对其进行可视化和量化。与早期的应用一样，这种方法能够更深入地洞察细胞随时间的全部生理特征和形态变化。另一个好处是，与 -Boyden chamber 实验相比，所需的细胞数量要少得多(少5-10倍)。 图7： NETosis 的量化。在 Incucyte@ Cytotox绿色染料(250nM) 和 CellROX Deep Red (5pM， Thermo Scientific) 存在下，用PMA(100nM)处理新鲜分离的人中性粒细胞。相位和荧光图像显示(A)活性氧(ROS， 红色，0-2小时)的瞬时产生，细胞核的解聚(30-60分钟)和细胞外 DNA的增加(绿色，>1小时)。PMA 引发快速、短暂的 ROS 生成增加(红色区域)，随后(1小时后) NETosis 生成(绿色区域，B)。DPI，一种已知的ROS抑制剂，以一种时间和浓度依赖的方式诱导 NETs 的衰减(C)。 9.病毒感染 在体外测量病毒在哺乳动物细胞中的感染性和复制能力对于我们了解病毒感染疾病、筛选新的抗病毒药物和疫苗以及免疫细胞佐剂至关重要。与传统的蚀斑实验和病灶形成实验相比，活细胞分析可以通过计算被荧光蛋白(如GFP)标记的病毒的细胞数量和程度来自动量化病毒的传播和复制能力。病毒滴度可以相应地被评价。 这种方法已在一系列病毒研究中被使用并发表，包括口蹄疫、基孔肯雅病毒和HCMV (Forrest， et al.， 2014；Stevenson，et al.， 2014；Tulloch， et al.， 2014； Herod， et al.，2016a，b； Stewart， et al.， 2015； Joubert，et al.， 2016)，也包括溶瘤病毒 (Berghauser， et al.， 2015)。HD图像和延时拍摄提供了对病毒传播的洞察力，对于引起细胞病变变病毒，也可以检测细胞的凋亡或坏死程度。 Incucyte@活细胞分析工作流程的一个有趣的优点是，当添加病毒或病毒复制体到细胞后，培养板不需要离开培养箱。因此，即使是高度传染性的病毒也可以在适当的生物隔离设施中安全地进行分析，而不会使操作者暴露在潜在的危险中。 10.抗体内化 单克隆抗体(mAb)和抗体偶联药物 (ADCs)被广泛用于 靶向免疫细胞，特别是在肿瘤免疫学和自身免疫性疾病中。这些生物制剂的一个关键特性是内化到不同细胞中的程度和速度决定了它们的疗效、安全性和药效曲线。 活细胞分析可以在96孔板中检测 Ab 内化。使用对 pH 值敏感的荧光染料检测 Ab 进入酸性溶菌酶的内化，其思路与吞噬作用类似(第6节)。标记是通过Fc结合片段(Incucyte@Fabfluor-pH染料)实现的，只需一步，无需洗涤，提供高效、高通通的样品制备。为了证明这一点，用 Incucyte@Fabfluor-pH染料标记了六种市售的CD71(转铁蛋白受体)抗体，进行了连续稀释(1：2，4.6-10，000 ng/mL) 并添加到 HT-1080 骨肉瘤细胞中。其中三种 Abs 产生了较大的内化信号，检测值<50 ng/mL， 而另外三种内化信号较弱，只有在较高浓度下才能看到。从对照孔中计算出的平均Z值为0.82， 表明该方法具有高度的稳定性和重复性(图8)。 同一表面蛋白的不同 Abs 具有不同的内化特征，这突出了实时活细胞分析的重要性。在生物药筛选和优化的关键步骤中，能够准确且高效地比较不同抗体候选药物，及生产批次的内化率将越来越重要。 A. Ab2 图8：抗体内化筛选。六种不同的 CD71抗体，包括来自两个不同供应商的克隆(克隆1a和1b)，在 HT-1080细胞中进行了头对头的测试。抗体在加入细胞前用 Incucyte@ Fabfluor-pH红染料标记，并在12小时内每30分钟采集一次内化信号(10倍物镜)。从 Incucyte@活细胞分析系统拍摄的平板视图显示，第11栏和第12栏有明显的阳性和阴性对照反应，每个抗体在两个平板上有浓度依赖反应(A)。抗体数据的头对头分析显示这些克隆的反应范围(B)，12小时的对照反应显示出明显的阳性反应。所有数据显示为八个孔的平均值。 从所描述的十个例子来看，活细胞分析适用于广泛的免疫细胞检测。一个关键点是，细胞在整个实验过程中保持不受干扰。因此，该方法很容易与其他分析技术结合起来。例如，可以对活细胞分析实验中的细胞上清液进行取样，并对细胞因子等分析物进行测量，还可以在实验结束后将细胞取出，用流式细胞仪、PCR和/或其他方法进行检测。 以完全无干扰的方式研究免疫细胞生物学的能力，解决了大多数检测方法只提供单一时间点测量的限制。通过细胞图像和延时摄影提供深刻的生物学洞察和验证，以及通过自动图像捕获和处理提高生产力，使活细胞分析成为研究免疫细胞生物学的一个强大方法。 ( Proliferation， Counting， Cell H ealth， and Apoptosis Zhang G， Gu r tu V， Kain S R ， Yan G. Early detection of apoptosis u sing a fluorescent conjugate of annexin V. Biotechniques， 23(3)；525-531(1997) ) ( Cen H， Mao F， Aronchikl， Fuentes RJ， Firestone GL. Devd-Nucview 488： A Novel Class of Enzyme Sub-strates for Real-Time Detection of Caspase-3/7 Activity in Live Cells. 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Huh7和Hep3B肝癌细胞系加入浓度增加的XL413和AZD8055后的克隆形成；b. Huh7和Hep3B肝癌细胞系加入浓度增加的XL413和AZD8055后的细胞凋亡XL413和AZD8005联合使用抑制体内肿瘤生长为了评估体外发现是否可以在体内重现，研究者制作了Huh7和MHCC97H异种移植物。与载体、AZD8055或XL413和AZD8055组合治疗的肿瘤相比，XL413治疗的肿瘤显示DNA损伤和SA-β-gal+衰老细胞增加对XL413和AZD8005的抑制作用表明CDC7在体内诱导衰老。与索拉非尼治疗相比，XL413和AZD8055联合治疗可更有效地抑制生长，而TP53突变的联合治疗异种移植物显示4EBP1的增殖和磷酸化减少，与凋亡增加相关。在这种侵袭性肝癌模型中，接受XL413或AZD8055单药治疗的TP53q敲除肿瘤显示出肿瘤体积的适度减少和小鼠寿命的延长，而XL413与AZD8055联合治疗的耐受性良好，与对照组相比，显著降低了肿瘤负担并提高了生存率。重要的是，在联合治疗组中，SA-β-gal阳性和p16（INK4A）阳性细胞的数量减少，这表明通过AZD8055治疗可以有效地消除衰老细胞。Summary本研究证实，使用CDC7抑制剂的促衰老疗法，结合mTOR抑制剂，可以减轻衰老细胞的细胞自主性和非细胞自主性，从而降低肿瘤复发的风险，从而为肝癌患者带来临床益处。利用诱发的脆弱性可能是治疗肝癌的有效方法。Download下载中文白皮书《活细胞分析在免疫学中的十大应用》了解Incucyte® 在免疫学及癌症分析中的应用亮点点击下载 获取全文-参考文献-【1】Wenxin Qin, Leila Akkari & René Bernards. Inducing and exploiting vulnerabilities for the treatment of liver cancer. Nature. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1607-3