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实验方法原理 当重组病毒通过噬斑纯化和扩增后,免疫印迹可用于鉴定重组蛋白,并检测其是否有预期的大小以及是否从感染细胞中分泌。下面的步骤是介绍检测非分泌性(细胞内)蛋白的,如果重组蛋白是分泌到培养基中的,可按注解中的步骤操作。实验材料 生长至汇片的单层 BS-C-1 细胞重组痘苗病毒储液试剂、试剂盒 完全 MEM-5 培养基胰酶细胞裂解液5 × SDS 样品缓冲液仪器、耗材 6 孔组织培养板Sorvall 离心机95℃ 水浴锅实验步骤1. 用生长至汇片的单层 BS-C-1 细胞建立病毒感染细胞培养液(见基本方案 1 步骤 1~5)。2. 用完全 MEM-5 培养基将 5×105 细胞/孔放入 6 孔组织培养板培养(每孔终体积为 2 ml)。直至细胞汇片生长(应小于 24 h)。3. 在使用前,将一定体积的痘苗病毒储液与 0.25 mg/ml 胰酶混合,涡旋混匀。在 37℃ 水浴锅中保温 30 min,并在保温过程中每隔 5~10 min 涡旋混匀一次。病毒储液的滴度常常在 2×109 pfu/ml 左右,但根据其来源的不同病毒滴度也可能低一些。如果经过涡旋混匀后,还可以看见团状物,将其冷却到 0℃ 并在冰上超声波作用 30 s。可以重复几次超声,但超声的间隔中应当使样品在冰上冷却。4. 吸出培养基,加入 1 ml (终体积)MOI 为 10~30 pfu/细胞的完全 MEM-5,培养 1~2 h,每隔大约 30 min 轻轻摇动培养板,使细胞均匀接触病毒。如果使用纯化的病毒,应在使用前在冰上超声 30 s (见基本方案 1 步骤 7)。如果分析的蛋白质分泌到培养基中,要注意在感染和培养细胞的培养基中不应添加血清或使用 1% 的血清,因为高浓度的血清会干扰胶的分析。5. 加入 2 ml 的完全 MEM-5 培养基,培养 24~48 h。6. 细胞刮刀轻轻刮下细胞,转移到离心管中,5~10℃,1800 g 离心 5 min,弃培养基。对于分泌性蛋白质,用 Centricon 10 microconcentrator (Amicon) 浓缩培养基,使体积缩小到原来的 1/5。此外,培养基中的蛋白质也可以按下面的方法用三氯乙酸(TCA) 沉淀:6.1 向样品中加入 Triton X-100 至终浓度为 0.03% (V/V);6.2 加入等体积 20% TCA;6.3 在冰上放置 15 min;6.4 4℃,以最大转速离心 15 min;6.5 吸出上清,用 70% 乙醇洗沉淀;6.6 空气晾干沉淀,加入 5 μl 1 mol/L Tris 碱,溶于 1 × SDS 样品缓冲液。7. 用 200 μl 细胞裂解液重悬细胞沉淀,将其转移至微量离心管中。涡旋混匀,在冰上放置 10 min。8. 4℃,最大转速离心 10 min。分离上清(细胞质)和沉淀(细胞核)。9. 在 20 μl 的上清中加入 5 μl 5 × SDS 上样缓冲液,95℃ 加热 5 min。将沉淀溶于 200 μl 的 1× SDS 样品缓冲液,95℃ 加热 5 min。10. 按免疫印迹方法进行操作。注意事项1. 所有培养都在加湿的 37℃ 5% CO2 培养箱中培养,除非有特殊说明。2. 与活细胞接触的器械和试剂都应该是无菌的,操作也必须无菌。3.细胞裂解液只含有非离子型去污剂,可能不能有效地抽提某些蛋白质。在这种情况下,需要含有 SDS 的缓冲液。
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上海远慕生物科技有限公司为您提供《表达蛋白检测实验操作步骤》,该方案主要用于其他中表达蛋白检测检测,参考标准《暂无》,《表达蛋白检测实验操作步骤》用到的仪器有pET-39b大肠杆菌蛋白表达载体,大肠系列质粒、结肠和肝肿瘤高表达蛋白抗体、oxoid 胰蛋白胨使用说明书。
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