【设备更新】NanoTemper抗体药物开发实验指南

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1什么是生物疗法？生物疗法，是一种利用人体免疫系统的癌症治疗方法。如果从操作模式的角度来区分，分为细胞治疗和非细胞治疗（包括抗体、多肽或蛋白质疫苗、基因疫苗、体内基因治疗等等）。其中，目前应用最多的就是抗体靶向治疗。单克隆抗体(mAb)自从1986年首次获得FDA批准以来作为一种治疗药物已有30多年的历史，进一步开发和优化更好的单抗生物疗法也在继续上升。基于单抗的疗法在治疗和预防许多疾病，包括癌症和自身免疫性疾病方面越来越受欢迎。在基于单抗的治疗药物的“质量源于设计”开发理念中，需要检测蛋白去折叠或变性的可能性即表征蛋白稳定性以确保整个开发和生产过程中蛋白结构和功能保持不变。抗体在成为治疗药物的过程中会受到极热、极冷、光照、试剂浓度和许多其他因素的不利影响。因此，稳定性表征分析是至关重要的，可以帮助研究人员开发和确定每种治疗药物最合适的配方和储存条件。实验指南来啦！NanoTemper 推 荐本期，我们将介绍用于检测生物治疗药物稳定性的各种技术，阐明单克隆抗体配方的来龙去脉，介绍新药临床试验申请(IND)和新药上市申请（NDA）的典型时间线，并深入研究存储条件如何影响单抗稳定性。如果您有兴趣了解更多关于生物治疗药物特性或存储和配方研究细节，请继续阅读。下载本书，您将深入浅出地了解到：1. 检测蛋白质构象和胶体稳定性的常用方法有哪些？2. 制剂开发的流程 & 如何开发具有稳定性的抗体制剂？3. 抗体IND和NDA申报流程mnoTEMPEr 抗体药物开发实验指南 —-如何检测稳定性，稳定性的重要性及工作流程 测定生物药稳定性的方法解密配方开发的流程&单克隆抗体I N D和NDA最佳的储存条件 [p.3]如何开发具有稳定性的申报之旅 [p.10]抗体配方?[p.9] 关于本指 南 单克隆抗体(mAb)自从1986年 首 次获得F D A批准以来作为一种治疗药物已有30多年 的历史，进一步开发和优化 更 好的单抗生物疗法也在继续上升。基于单抗的疗法在治 疗和预防许多疾病，包括癌症和自身免疫性疾病方面越来越受欢迎 。在 基 于单抗的治 疗药物的“质量源于设计”开发理念中，需要检测蛋白去折叠或变性的可能性 即 表征蛋 白稳定性以确保整个开发和生产 过程 中蛋白结构和功能保持不变 。抗体在成为治疗药 物的过程 中 会受到极热、极冷、光照、试剂浓度和 许 多 其 他因素的不利影响 。因 此 ，稳定 性表 征 分析 是 至关重要的，可以帮助研究人员开发和确定每种治疗药物最合适的配方 和 储存条件。 在本指南中，我们将介绍用于检测生物治疗药物稳定性 的 各种技术，阐明单克隆抗体 配方的来龙去脉，介绍新药临床试验申请(IND)和新药上市申请(NDA)的典型时 间 线，并深入研究存储条件如何影响单抗稳定性 。如果您有兴趣了解 更 多关于生物治 疗 药物 特性或存储和配方研究细节，请继续阅读 。 检测生物治疗药物稳定性的方 法 确保抗体或抗体片段成为有效的药物，需要在整个开发和生产过程中持续监 测 其稳定性。抗体稳定性受 多种 因 素的影响，包括存储温度、蛋白质结构、溶液浓度、光照或加热以及存储缓冲液。其中一些因素，会 在 工 艺开发和制造过程中遇到，可导致生物药发生聚集，化学或热变性一导致其功能受损，导致给药时 无效甚至是有害的。下面介绍一些监 测 蛋白质构象和胶体稳定性的常用方法 。 蛋白 质 聚集影响生物药的安全性和有效性。例如 聚集体可能会引起严重 的 免疫反应。聚合可发生 在整个抗体生产过程中，从早期细胞培 养 中的表 达检 测 到治疗药物获批后准备给药。科研人员在 进行稳定性研究时必须使用对检测聚集高度敏 感的分析方法，如体积排阻色谱法。 体积排阻色谱法(SEC)用于分析和定量可溶性 聚 体 。它测量蛋白质粒子、二聚体和高聚物的存 在。SEC通常使用高效液相色 谱 法(HPLC)或超高 效液相色谱法(UPLC)进行，并使用280或214nm 的 吸收波长对洗脱组分进行检测。研究人员通常 检测到几个峰，每个峰代表蛋白质颗粒、单体、二 聚体或高聚物。理想情况下，大多数抗体是可溶 的稳定单体状态。 热变性实验依赖于强 制 降解测 试 ，其中生物药受 到越来越高的温度 影 响导致它们发生变性。这 一 过程 可 以通过检测50%抗体发生去折叠时的熔解 温度(T)来预 测 1。 化学变性实验以类似的方式工作，只不过是使用 化学变性剂，如胍盐酸盐或尿素来使使蛋 白 质完 全变性。从蛋白去折叠曲线中研究人员可以计算 蛋 白 去折叠的吉布斯自由能的变化AG和变性中点 浓度C ，理论上，AG 、C或T越大，分子的结构或 构象越稳定。以下 是 检 测 生物药热变性和化学变 性最常用的技术。 差 示 扫描量热法(DSC)通过测量与分子恒速加热时 热变性相关的热量变化予以 实 现，可以预 测 热稳 定性 。通常研究人员将抗体溶液放入固定的样品 池中，并将相应的缓冲液放入参比池。然后以恒定 的扫描 速 率对 其 进行加热。当蛋 白 质展开 导 致两 池之间有温差 (AT)时就会发生热吸收，从而在整 个珀耳帖单元内形成热梯度 。该技术被认为 是 检 测热稳定性的标准方法，但缺点是需要耗费大量 样品。 差示扫描荧光法(DSF)是 另 一 种检测抗体热变性 的常用方法。研 究 人员向样品中添加外源荧光染 料(通常是SYP R O o r an ge )， 并在逐 渐 升温的过程 中 监 测荧光强度变化，从而计算其熔解温 度 T 3。 圆 二色谱(CD)是 一种光谱技术，测量物质对左右 圆偏振光吸收的差值。可用于 检测 蛋白去折叠的 范霍夫焓(^H)和熵(△S)，熔解或变性 中 点 温 度(T 或C ，，)以及吉布斯自由能(AG)。该技术的局限性在 于样品消耗量大，解析复杂蛋白质的光谱可能需 要几个小 时 。 nanoDSF是DSF 的 一种改良技术，不需要添加外 源染料。通过色氨酸或酪氨酸残基的内源荧光就 可以监测蛋白热变性或化学变性。350 nm 和330nm处的荧光强度比可以检测热变性或化学变性 引起的蛋 白 质结构变化。利用 n anoDSF，研究人员 可在使用很少样品的情况下获得精确的去折叠温 度(T和 Tose )化 学变性参数(Cm)和折叠自由 能 (AG)，从而加速生物药开发进程 。 在抗体生产和长期储存过程中 ，蛋白质的稳定性是药物研发人员面临的一个挑战。必须确 保适当剂量的活性抗体在给药时抵达体内正确的作用部位，药物在储存期间 是 稳定的。产 品可用时应尽 快 启动制剂开发 一 即使工艺开发活动产生 的 产品有可能不能完全代表最终 工艺1。一般在药物发现后4-5个 月 即可获得产品；此时开始进行预制剂开发，紧 随 其后的 是 临床制剂开发。通常需要几种辅料的混合物(与活性成分 一 起使用时可能会产生益处的惰 性物质)来稳定抗体 。因 此研发人员必须测试不同的 制 剂条件，包括不同的pH值条件、离 子 强度、缓冲剂和稳定剂。 制剂开发阶段 在临床前药物开发阶段(在新药临床试验申请 [IND ]之前)，必须进行产 品 表征测试以确保最终 产品安全、有 效并且批次之间是 一 致的。这些活动被称为CMC：chemistry， manufacturing ，a n d co n trol 。一般来说，抗体的CMC研究大约需要18个 月 ，包括以下内容5： 1.分析方法开发 2.细胞系选择与优化 3.纯化 工 艺开发 4.制剂开发 a . 预制剂开发大约在药物发现后4-5个 月 进行。预制剂是研究人员对药物 的物理和化学性质进 行 表征的研究和开发阶段。 b. 临床制剂开发发生在预制剂开发之后，大约在药物发现后8-9个月。该 阶段研发人员将确认临床试验中所使用的制剂 。 5.分析方法验证并转移至质控部门 6.产品表征 7治疗性蛋 白 原液(DS)生 产 8 DS稳定性初步研究 9.临 床前药物成品(DP)生产 10.DP稳定性初步研 究 11.临床试验申 请 制剂因 素 由于抗体通常通过注 射 给药，它们一般被配制成冻干粉，或 是 直接注射的溶液。在生产、加工、装填 和以及储存过程 中 ，需要加入各种辅料来稳定抗体。合适的辅料有助于开发新的生物药和 稳 固的产 品 。当决定在生物制剂中添加 哪 些辅料时，研 究 人员必须在常规范 围 内考 虑 以下 因 素6。 冲液(类型和浓度)：5-100mM pH 值 范围 ：4.0-8.0 稳定剂 ：如冷冻保护剂1-10% 盐浓度：0-300mM 表面活性剂 浓 度：0.01-0.1%(w/v) 辅料种类 辅料在抗体治疗制剂 中 具有多种作用 ，从提高溶解度、工艺和储存稳定性 到 控制 pH 值和毒 性。新的 辅 料 一 直在被考虑；国际药物辅料理事会(IPEC)是 一 个行业协会，致力于制定和协调国际辅料标准，提供 有 关辅料的指导 。开发抗体和其他生物制剂时要考虑的辅料类别包括6 缓冲液：醋酸、琥珀酸、柠檬酸、组氨酸、磷酸盐、三羟甲 基 氨 基 甲烷 氨基酸：精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、脯氨酸、甘氨酸、组氨酸、甲硫氨酸 稳定剂和膨松剂：乳 糖 、海藻糖、葡萄 糖 、蔗糖、山梨醇、甘油 、白蛋白 、明胶、甘 露 醇、右旋糖酐 表面活性剂： Tween 20、 T ween 80、Pluronic F68 防腐剂：苯甲醇、间 甲酚、苯酚、2-苯氧乙醇·螯合剂：Ca²+、Zn?+、EDTA 其 他：盐，聚阴离子，环糊精基赋形 剂 在制剂开发过程中，研究人员在不同的时间点和 温 度下测 试 不同制剂 中 的稳定性差异，以确认最终 的制剂 。 U 抗体IND和NDA申报流程 最佳的储存条 件 在生产过程中，不适当的储存条件和 暴露 在极端温度 下 对抗体的结构 有 不利影响。制药 行业的科学家在开发新的抗体药物时，会在不同温度 下 储存不同时间后，定期 测 试抗体 的稳定性。强 制 降解研究测试严峻的储存条件对抗体的影响；测 试的温度和化学浓度比 抗体在储存或生产过程 中 可能遇到的条件更极端。 降解 测 试是 生 物药 生 产过程 中 的关键环节；测试实验中由抗体去折叠和聚集产生的降 解产物，可 用 于评估分子的稳定性 。早 期稳定性 测 试通常使用高通量的方法检 测 几项关 键参数，如聚集，纯度等。 每个Ig结构域 在 不同的温度 下 开始去折叠。例 如 ，I gGs的恒定重链3 (CH3)结构域比其CH2结 构域在 更 高的温度下去折叠。在一定温度 下 ，抗 体溶液中具 有 折叠和去折叠结构的混合物。单 一 多肽链中折叠和去折叠结构域的共 存 可能 会增加聚集的倾向，从而使抗体失活13。在高于 65℃的温度 下 ，Ig G变性变得不可逆，在90℃热 处理几分钟后，IgG 几乎完全失去其抗原结合 活 性 13。 强制降解展示了稳定性指示方法的特异性，也 提供了对原料药降解途径和降解产物的深入了 解。该研究还有助于阐明降解 产 物的结构，了解 分子的化学行为。反过来又有助于开发制剂和 包装12。 强制降解研究是对原料药(DS) 进行的一该活 性成分旨在提供药理活性或在诊断、治愈、缓 解、治疗或预防疾病方面的其他直接作用，或 影 响人体的结构或任何功能，但不包 括 用于合成 此类成分 的 中间体[21 CFR 314.3]。它们也用于 药品(DP)，成品 剂 型 ，例如片剂、胶囊或溶液，含有一种药物或与一种或多种其他成分结合 [21 CFR 314.3]14。强制 降 解是指在比通常遇到 的 条件更严 苛的 条件下降解原料药或药品。 常用的强制 降 解条件包括高温、冻 融 、搅拌、高 p H 值、低pH值、光照、氧化和糖基化。这些都是在加 工 、包装、运输和处理过程中可能出现的情况。虽 然这些条件 与 现实生活中的储存和生产条件相 比相对严 苛 ，但我们可以在相当短的时间内 得到 降解产物并阐 明 降解趋势14。 为了阐明各种条件对抗体稳定性的影响，研究人 员可以使用高通量测试。这在抗体开发的早期阶 段特别有用，因 为降解研究可能受到有限的样品 量和时 间 的限制 。在选择主要候选药物之前，高 通量测试也可用于筛选多种候选药物。研究人员 应使 用 对降解产物敏感的方法 ，包 括 聚集体、脱 酰 胺和 氧 化产物。高通量方法的例子包括用于 测 量纯度的毛细管电泳 - SDS (CE-SDS)，用于 测 量 电荷异质性的CE等电聚焦(CE-IEF)， 以及用于 测 量聚集和去折叠的nanoDSF 14。 总结 迄今为止，已 有 超过79种治疗性抗体被美国FDA批准为可上市药物15。致 力于开发 更 有效的抗体生物疗法的研究正持续增长。除了支持潜在新靶 点 的识别和发现外 ，在药物开发过程的早期监测抗体分子的稳定性和聚 集也同样重要。虽然有许多可用的方法来监 测 稳定 性 ，但重要的 是 要选择 最能满足您需求的方法。需要考虑的一些关键特征 是 样本 量、外源试剂的 加入、获得结果的时间、通量需求和检测成本。此 外 ，需 要优化适当的配 方，以保持药 品 在储存期间的稳定 。 总的来说，选择最佳的方法并对影响稳定性的各种因素的清 晰 理解，有 助 于加速抗体的开发过程，并 更 快地为患者带来 更 有效的生物治疗药物。 参考文 献 1L .，G . 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