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实验概要本实验介绍了溶菌酶(lysozyme)的制备及其性质测定的原理和操作方法。实验原理溶菌酶(lysozyme)是由弗莱明在1922年发现的,它是一种有效的抗菌剂,全称为 1,4-β-N-溶菌酶,又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。活性中心为天冬氨酸52和谷氨酸35,是一种糖苷水解酶,能催化水解粘多糖的N- 乙酰氨基葡萄糖(NAG)与N-乙酰胞壁酸(NAM)间的β-1,4糖苷键,相对分子质量14700Da,由129氨基酸残基构成,由于其中含有较多碱性氨基酸残基,所以其等电点高达10.8左右,最适温度为50度,最适PH为6~7左右。在280nm的消光系数为 13.0。该酶活性可被一些金属离子Cu2 ,Fe2 ,Zn2 (10-5~10-3M)以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制,能被Mg2 ,Ca2 (10-5~10-3M)、NaCl所激活。溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内,鸡蛋(含量约为2%~4%)和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源,目前,溶菌酶仍属于紧销的生化物质,广泛应用于医学临床,具有抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等多种药理作用。溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性,在中性条件下溶菌酶带正电荷,因此在分离制备时,先后采用等电点法,D152型树脂柱层析法除杂蛋白,再经Sephadex G-50层析柱进一步纯化。最后用SDS-PAGE 鉴定为一条带。采用福林酚法测蛋白含量,分光光度法测定酶活性。主要试剂1. 鸡蛋清(鲜鸡蛋)2. 底物微球菌粉3. D152大孔弱酸性阳离子交换树脂4. 固体氯化钠(NaCl)5. 固体硫酸铵(NH4)2SO46. 固体磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)7. 固体磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)8. 固体磷酸钠(Na3PO4)9. 乙醇;蒸馏水;甲醇;考马斯亮蓝;三氯/醋酸;丙酮10. 溶菌酶标准品;Sephadex G5011. N-乙酰葡萄糖胺;硫酸铜;硫酸亚铁;硫酸锌;氯化镁;氯化钙;氢氧/化钠;盐酸12. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂;蛋白含量测定(福林法)试剂13.聚乙二醇-20000、两性电解质主要设备1. 循环水式真空泵 HSB-IⅡ2. 蛋白紫外检测仪3. 记录仪4. 紫外分光光度计5. 梯度混合器(500mL);6. 721型光分光光度计7. 冰冻离心机8. 冰箱9. 透析袋10. 酸度计11. 部分收集器12. 恒流泵13. 圆盘电泳装置14. 恒温水浴锅15. 层析柱(2.6×1250px)(1.6×750px)16. 布氏漏斗(500mL)17. 吸滤瓶 (1000mL)18. G-3砂芯漏斗(500mL)实验步骤1. 蛋清的制备将4~5个新鲜的鸡蛋两端各敲一个小洞,使蛋清流出(鸡蛋清pH 值不得小于8),轻轻搅拌5分钟,使鸡蛋清的稠度均匀,用两层纱布过滤除去脐带块,量体积约为100ml.2. 鸡蛋清粗分离按过滤好的蛋清量边缓慢搅拌边加入等体积的去离子水,均匀后在不断搅拌下用1mol/L HCl调pH值至7左右,用脱脂棉过滤收滤液。3. D152大孔弱酸性阳离子交换树脂层析1) D152树脂处理:将D152树脂先用蒸馏水洗去杂物,滤出,用1mol/L NaOH搅拌浸泡并搅拌4~8小时,抽滤干NaOH, 用蒸馏水洗至近pH7.5, 抽滤干, 再用1mol/L HCl按上述方法处理树脂,直到全部转变成氢型,抽滤干HCl , 用蒸馏水洗致近pH5.5,保持过夜,如果pH之不低于5.0,抽滤干HCl,用2mol/LNaOH处理树脂使之转变为钠型,pH值不小于6.5。吸干溶液,加pH6.5 0.02mol/L的磷酸盐缓冲液平衡树脂。2) 装柱:取直径40px,长度为750px的层析柱,自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液,关闭层柱出口,待树脂沉降后,放出过量的溶液,再加入一些树脂,至树脂沉积至15~500px高度即可。于柱子顶部继续加入 pH6.5, 0.02mol/L磷酸盐缓冲液平衡树脂,使流出液pH为6.5为止,关闭柱子出口,保持液面高出树脂表面25px左右。3) 上柱吸附:将上述蛋清溶液仔细直接加到树脂顶部,打开出口使其缓慢流入柱内,流速为1ml/min。4) 洗脱:用柱平衡液洗脱杂蛋白,在收集洗脱液的过程中,逐管用紫外分光光度计检验杂蛋白的洗脱情况,当基线开始走平后,改用含1.0mol/L NaCl的pH值6.5,浓度为0.02 mol/L 磷酸钠缓冲液洗脱,收集洗脱液。5) 聚乙二醇浓缩:将上述洗脱液合并装入透析袋内,置容器中,外面覆以聚乙二醇,容器加盖,酶液中的水份很快就透析膜外的聚乙二醇所吸收。当浓缩到5mL左右时,用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇,小心取出浓缩液。 6) 透析除盐:蒸馏水透析除盐24小时。4. Sephadex G50分子筛柱层析1) 装柱:先将用20%乙醇保存的Sephadex G50抽滤除去乙醇,用 6g/LNaCl溶液搅拌Sephadex G50数分钟,再抽滤,反复多次直至无醇味为此。(如果Sephadex G50是新的,则按实验五中的方法处理凝胶)。加入胶体积1/4的6g/L NaCl溶液,充分搅拌,超声除去气泡,装入玻璃层析柱(1.6×1250px),柱床1125px。2) 上样。3) 洗脱:样品流完后,先分次加入少量6g/L NaCl洗脱液洗下柱壁上的样品,连接恒流泵,使流速为0.5mL /min,用部分收集器收集,每10分钟一管。4) 聚乙二醇浓缩:合并活性峰溶液,用聚乙二醇浓缩到5mL左右时,用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇,小心取出浓缩液。5) 透析除盐:蒸馏水透析除盐24小时。收集透析液,量取体积。5. 溶菌酶活力测定1) 酶液配制:准确称取溶菌酶样品5mg, 用0.1mol/L,pH6.2磷酸缓冲液配成1mg/ml的酶液,再将酶液稀释成50?g/ml。2) 底物配制:取干菌粉5mg加上述缓冲液少许,在乳钵中(或匀浆器中)研磨2分钟,倾出,稀释到15~25ml,此时在光电比色上的吸光度最好在0.5~0.7 范围内。3) 活力测定:先将酶和底物分别放入25度恒温水浴预热10分钟,吸取底物悬浮液4mL放入比色杯中,在450nm波长读出吸光度,此为零时读数。然后吸取样品液0.2mL(相当于10?g酶),每隔30s读1次吸光度,到90s时共计下四个读数。活力单位的定义是:在25℃,pH6.2,波长为450nm时,每分引起吸光度下降0.001为1个活力单位。酶的活力单位数=△A450nm/t×0.001比活力=酶的活力单位数/mg蛋白质6. 蛋白质含量的测定采用Folin-酚试剂法进行测定。7. 纯度检测采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。8. 理化和酶学性质的测定可根据酶纯化和活力测定的结果,运用已掌握的生化知识和实验技能自行设计方案进行探索研究。9. 实验结果步骤项目 体积(ml)总蛋白量(mg)总活力单位比活力(单位/mg)回收率(%)1.制备蛋清2.溶菌酶分离3.D152树脂柱层析4. Sephadex G50层析
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上海远慕生物科技有限公司为您提供《溶菌酶的制备原理和操作方法》,该方案主要用于其他中溶菌酶检测,参考标准《暂无》,《溶菌酶的制备原理和操作方法》用到的仪器有进口溶菌酶(来源于鸡蛋清)12650-88-3、人溶菌酶(LZM)酶联免疫试剂盒,人ELISA试剂盒。
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