等边浅蛤（沙蛤）肉中蛋白质、非蛋白氮、脂肪含量的检测

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等边浅蛤肉酶解产物超滤组分免疫调节作用广东海洋大学学报Journal of Guangdong Ocean University第 40卷 第 3期2020年 5月Vol.40 No.3May 2020 第3期丁霈希等：等边浅蛤肉酶解产物超滤组分免疫调节作用115 丁霈希，章超桦，高加龙，等 .等边浅蛤肉酶解产物超滤组分免疫调节作用 [J].广东海洋大学学报，2020，40（3）：114-121. 等边浅蛤肉酶解产物超滤组分免疫调节作用 丁霈希 1，章超桦 1,2,3,4,5，高加龙 1,2,3,4,5，秦小明 1,2,3,4,5，曹文红 1,2,3,4,5，郑惠娜 1,2,3,4,5，林海生 1,2,3,4,5 （1.广东海洋大学食品科技学院，广东湛江 524088；2.海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，辽宁大连 116034；3.广东省水 产品加工与安全重点实验室 //4.广东普通高等学校水产品深加工重点实验室 //5.国家贝类加工技术研发分中心（湛江），广东湛江 524088） 摘 要：【目的 】探讨等边浅蛤（Gomphinaaequilatera ）肉的基本营养成分、蛋白质氨基酸组成及中性蛋白酶酶 解产物超滤组分的免疫活性。【方法 】采用中性蛋白酶酶解等边浅蛤肉，利用 3 ku 超滤膜对等边浅蛤肉酶解产物 进行超滤分离，通过细胞实验和动物实验评价小于 3 ku 和大于 3 ku 两个超滤组分的免疫调节作用。【结果 】等边 浅蛤肉具高蛋白低脂肪特点，其氨基酸种类和含量丰富。细胞实验表明，＜3 ku 组分的细胞相对增殖率及吞噬中 性红能力均显著高于阳性对照组（P ＜0.05），其中质量浓度为 250 μg/mL 时细胞相对增殖率高达 126.22%；动物 实验表明，与空白对照组相比，＜3 ku 组分能够极显著提高迟发型变态反应（DTH ）程度、半数溶血值（HC50）、抗体生成细胞数、吞噬指数及 NK 细胞活性（P ＜0.01）。细胞实验和动物实验均表明＜3 ku 组分的免疫调节作用 优于＞3 ku 组分。【结论 】等边浅蛤肉酶解产物的＜3 ku 超滤组分具有一定的免疫调节作用。 关键词：等边浅蛤；酶解产物；超滤组分；免疫调节作用 中图分类号：TS254.1 文献标志码：A 文章编号 : 1673-9159（2020）03-0114-08 doi : 10.3969/j.issn.1673-9159.2020.03.015 Immunomodulatory Effects of the Ultrafiltration Fractions of Enzymatic Hydrolysates from the Edible Part of Gomphina aequilatera DING Pei-xi1, ZHANG Chao-hua1,2,3,4,5, GAO Jia-long1,2,3,4,5, QIN Xiao-ming1,2,3,4,5, CAO Wen-hong1,2,3,4,5, ZHENG Hui-na1,2,3,4,5, LIN Hai-sheng1,2,3,4,5 （1. College of Food Science and Technology , Guang dong Ocean University , Zhanjiang 524088, China ；2. Collaborative Innovation Center of Seafood Deep Processing , Dalian 116034, China ；3. Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guang dong Higher Education Institution //4. National Research and Development Branch Center for Shellfish Processing , Zhanjiang 524088, China //5. Guang dong Provincial Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety , Zhanjiang 524088, China ） Abstract:【Objective 】 This study investigated the essential nutrients, amino acid composition of proteinandtheimmunoactivityoftheultrafiltratedenzymatichydrolysisproductsof Gomphina aequilatera meat.【Methods 】A 3 ku ultrafiltration membrane was used to separate the neutral protease hydrolyzate of the Gomphina aequilatera ，and then cell and in vivo experiments were conducted to test the immunomodulatory effects of ultrafiltration components. 【Results 】Gomphina aequilatera meat 收稿日期 ：2019-12-31 基金项目 ：广东海洋大学创新强校工程重大科研成果培育计划（GDOU2017052606）；国家贝类产业技术体系项目（CARS-49）；广东普 通高等学校水产品高值化加工与利用创新团队项目（GDOU2016030503） 第一作者 ：丁霈希（1994－），女，硕士研究生，主要研究方向为水产品高值化利用。E-mail ：18320274250@163.com 通信作者 ：章超桦，教授。E-mail ：zhangch2@139.com has high contents of protein and low fat level. Its amino acid species and content are rich. Result of cell experimentsshowedthattherelativeproliferationrateandtheabilitytodevourneutralredof ultrafiltration component with MW <3 ku were higher than those of the positive control group (P ＜0.05). When the mass concentration is 250 μg/mL the relative proliferation rate was as high as 126.2%. In vivo data showed that the degree of delayed allergic reaction (DTH), hemolytic value (HC50), the number of antibody-producing cells, phagocytic index and NK cell activity were higher than these of controls (P <0.01).Bothcellcultureandinvivoresultsshowedthattheimmunomodulatoryeffectofthe ultrafiltration component with molecular weight <3 ku was better than that of >3 ku. 【Conclusion 】The <3 ku hydrolyzate fraction from the of Gomphina aequilatera has immunomodulatory effects. Key words: Gomphina aequilatera ; Enzymatic hydrolysate; Ultrafiltration fractions; Immunomodulatory effects 《中国卫生健康统计年鉴 2018》统计数据显 示，2017年心脑血管病、癌症和慢性呼吸系统疾病 等慢性疾病是我国城乡居民主要致死病因，占比超 过 80% [1]。因此，越来越多人关注如何提高人群机 体免疫力。食源性免疫活性肽无毒、低敏、安全性 高且可以调节人和动物机体免疫能力，在人类营养 健康和疾病调节中发挥着不可替代的作用 [2]。而海 洋类动物由于生长环境特殊，因此体内氨基酸结构 与陆地动物不同，其分离出活性肽带正电荷与显负 电性的细胞因子受体大量结合，增强机体免疫力 [3]。海洋贝类中马氏珠母贝（Pinctada martensi ）[4]、青 蛤（Cyclinasinensis ） [5-6]、波纹巴非蛤 (Paphia undulate ) [7]、文蛤（Meretrix meretrix ）[8-10]、牡蛎 （Oyster ）[11-13]、扇贝（Chlamys fareri ）[14]、贻贝 （Mytilus edulis ）[15]等均被证明存在免疫活性肽。 等边浅蛤（Gomphina aequilatera ）隶属瓣鳃纲 （Lamellibranchia ），异齿亚纲（Heterodonta ），帘蛤 目（Veneroida ），帘蛤科（Veneridae ），浅蛤属 （Gomphina ），别名“沙蛤”[16]，属于广温广盐性种 类，在我国南北海岸均分布，是一种栖息于潮间带 中、下潮区泥砂质底营底栖生活的经济贝类 [17]。等 边浅蛤一般以带壳鲜销为主，少数加工为罐头制品 和干制品。近年来等边浅蛤虾塘和滩涂养殖规模不 断扩大 [18]，为提高其产品附加值，本研究对等边浅 蛤的基本营养成分和氨基酸组成进行分析，并对等 边浅蛤肉酶解产物超滤组分的免疫活性进行评价，以期为等边浅蛤肉高值化开发利用提供基础数据。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 1.1.1 材料 等边浅蛤（Gomphina aequilatera ）， 壳长（3.8 ± 0.2）cm ，购自汕尾，开壳取肉后-40 ℃贮藏备用。 1.1.2 试剂 中性蛋白酶（3.2 × 104 U/g ），购自广 西庞博生物科技有限公司；中性红，购自天津市天 新精细化工有限公司；脂多糖（LPS ）、噻唑蓝 (MTT)，购自美国 Sigma 公司；磷酸缓冲盐溶液 (PBS)、胎牛血清、1640无血清培养基 (RPMI-1640)、青 /链霉素双抗、dulbecco'smodified eagle medium 培养基（DMEM ），购自美国 Gibco 公司；20%绵羊 红细胞，购自蕊特生物技术有限公司；印度墨汁、乳酸脱氢酶（LDH ）、水杨酸缓冲液（SA 缓冲液）、碘硝基氯化四氮唑蓝 (INT)、乳酸锂，购自上海源叶 生物有限公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD)，购 自北京索莱宝科技有限责任公司；聚乙二醇辛基苯 基醚 (TRITONX-100)，购自碧云天生物技术有限公 司；都氏试剂，购自雨朵生物技术有限公司；吩嗪 硫酸甲酯 (PMS)，美仑生物技术有限公司；豚鼠血 清，购自鸿泉生物技术有限公司公司；红细胞裂解 液，购自白鲨易生物有限公司；盐酸左旋咪唑片，购自南国药业有限公司；其余试剂，均为国产分析 纯。 1.1.3 细胞 RAW264.7巨噬细胞、小鼠淋巴瘤细 胞（YAC-1）购自中科院上海细胞库。 1.1.4 动物 SPF 级昆明种雄性小鼠，4周龄，体 质量（20 ± 2）g ，合格证号 SCXKL （鲁）20140007，购自济南朋悦实验动物繁殖有限公司；饲养于广东 海洋大学 SPF 级动物房，许可证号 SYXK （粤）2019-0204。 1.2 仪器与设备 VULCAN 3-550 PD 马福炉，美国 Vulcan 公司； VAPODEST450全自动凯氏定氮仪，德国 Gerhardt 公司；WTM-CM-01陶瓷膜分离设备（杭州沃腾膜 有限公司）；FA2104A 电子分析天平（上海天平仪 器厂）；旋转蒸发仪Ｒ -1005（郑州长城科工贸有 限公司）；HHT4-LX-C50L 型立式压力蒸汽灭菌器 （北京中西远大科技有限公司）；CKX41型倒置显 微镜（日本 Olympus ）；SW-CJ-2FD 型超净工作台 （苏州净化有限公司）；Forma370型 CO2恒温箱、MultiskanFC 型酶标仪（Thermo 公司，美国）； TDL-5-A 低速离心机（上海安亭科学仪器厂）。 1.3 方法 1.3.1 等边浅蛤肉基本成分分析 水分测定：常压 干燥法 (GB/T5009.3－2016)；粗蛋白、非蛋白氮测 定：凯氏定氮法 (GB/T5009.5－2016)；灰分测定：高温灼烧法 ( GB/T5009.4－2016)；粗脂肪测定：索 氏提取法 ( GB/T5009.6－2016)；总糖含量测定：苯 酚硫酸法。 1.3.2 等边浅蛤肉氨基酸组成分析 等边浅蛤肉 水解后用氨基酸自动分析仪测定除色氨酸（Trp ）、半胱氨酸（Cys ）以外的 16种氨基酸 [19]。 1.3.3 等边浅蛤肉酶解产物超滤组分的制备 冻 藏等边浅蛤肉解冻后加适量水用组织搅碎机匀浆，匀浆液中加水调终最终料水比为 1∶3（g/mL ），加入 原料质量分数 1%的中性蛋白酶，50 ℃下酶解 3h 后沸水浴灭酶 15 min ，酶解液于 8 000 r/min 离心 20 min （4 ℃），收集上清。利用 200 μm 无机陶瓷 膜微滤装置过滤除去大分子物质、胶体颗粒及杂质 后选择 3 ku 超滤膜对其进行分级处理。 1.3.4 细胞实验 1.3.4.1 MTT 法检测细胞活性 RAW264.7巨噬 细胞浓度调整为 1 × 105个 /mL 后接种到 96孔板，100 μL/孔。培养 16 h 后加药，设空白对照组，阳 性对照组 (20 μg/mL LPS)和加药组 A 、B 、C 、D 、E （浓度为 4倍梯度稀释，从小到大依次为 50、100、250、500、1 000 μg/mL ），每个组设 6个平行孔。24 h 后每孔加 20 μL 5%MTT 溶液，孵育 4 h 后去 除上清，加入 200 μL 的 DMSO ，充分震荡 10 min ，于酶标仪 490 nm 处检测吸光值，计算相对增殖率。1.3.4.2 中性红法检测细胞吞噬能力 RAW264.7巨噬细胞浓度调整为 5 × 105个 /mL 后接种到 96孔 板，100 μL/孔。培养 16 h 后加药，24 h 后每孔加 20 μL 10%中性红溶液，孵育 2 h 后去除上清，PBS 洗板后加入 200 μL 的裂解液，充分震荡 10 min ，于酶标仪 540 nm 处检测吸光值。 1.3.5 动物实验 1.3.5.1 分组、给药 经过 7 d 适应期后，330只 昆明小鼠随机分 11组，每组 30只（包括 A 、B 组）每天定时灌胃，每周称质量，连续 30 d 。分为空白 组（蒸馏水）、阳性组（左旋咪唑 40 mg·kg-1·d-1）、酶解产物低（40 mg·kg-1·d-1）中（80 mg·kg-1·d-1）高（160mg·kg-1·d-1）剂量组、＞3ku 低（40mg·kg-1·d-1）中（80 mg·kg-1·d-1）高（160 mg·kg-1·d-1）剂量组、＜ 3ku 低（ 40mg·kg-1·d-1）中（80mg·kg-1·d-1）高（160 mg·kg-1·d-1）剂量组。 1.3.5.2 碳廓清指数法检测吞噬指数 按体质量从 小鼠尾静脉注入稀释 4倍的印度墨汁（100 mL/kg ）后立即计时。注入墨汁后 2、10min ，分别从小鼠 的内眦静脉丛取血 20 μL ，并立即加入 0.1% Na2CO3溶液 2mL ，在 600 nm 处检测吸光值，以 Na2CO3做空白对照。将老鼠处死后，取肝脏和脾脏，分别 称质量。 其中，D 1表示第 1次取血测的吸光度；D 2表示第 2次取血测得的吸光度，t 1表示注入墨汁后第 1次从 内眦静脉丛取血的时间；t 2表示注入墨汁后第 2次 从内眦静脉丛取血的时间。a 表示吞噬指数，m 身体 表示体质量，m 肝表示肝质量，m 脾表示脾质量。 1.3.5.3 乳酸脱氢酶法 （LDH ）检测自然杀伤（NK ）细胞活性 脾细胞悬液制备方法：无菌处死小鼠后 取脾脏置盛有 Hank’s 液的平皿中，用注射器活塞研 磨，使单个细胞游离出来；1 000×g 离心 10 min ，弃上清液，用 Hank’s 液洗涤后将细胞悬浮于 RPMI1640完全培养液，台盼蓝染色计数活细胞数 （应在 95%以上），调整细胞浓度为 2 × 107个 /mL 。制备细胞浓度为 2 × 107个 /mL 脾细胞悬液（效应 细胞）和细胞浓度为 4 × 105个 /mL YAC-1细胞悬液 （靶细胞）。取靶细胞和效应细胞各 100 µL （效靶 比 50∶1），加入 96孔板中，细胞自然释放孔加靶 细胞及培养液各 100 µL ，靶细胞大最大释放孔加靶细 胞和 1% NP40各 100 µL ；上述各项均设 3个平行 孔，于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养 4 h ，然后将 96孔板 1 500 r/min 离心 5 min ，每孔取上清 100 µL 于 96孔板中，同时加入 LDH 基质液 100 µL ，反应 3 ~ 10 min ，加入 1 mol/L HCl 30 µL ，在 490 nm 处 检测吸光值。 NK 细胞活性 =( D 反应孔- D 自然释放孔 )÷ 1.3.5.4 半数溶血值（HC50）法检测血清中溶血素 取用 SA 缓冲液 200倍稀释的血清 1 mL ，依次加入 体积分数为 10% SRBC 0.5 mL ，和用 SA 缓冲液稀释 9倍的补体 1 mL 。另设不加血清的对照管。置 37 ℃恒温水浴锅中水浴 15 ~ 30min 后，冰浴终止反应。2 000 r/min 离心 10 min 后取上清 1 mL ，加都氏试剂 3.75 mL ，体积分数为 10% SRBC 0.25 mL 。充分混 匀后，放置 10 min ，于 540 nm 处检测吸光值。 1.3.5.5 抗体生成细胞测定 小鼠采血后，迅速摘 取脾脏，用生理盐水冲洗干净，处理并配制成 4 ×106个 /mL 浓度的脾细胞悬液。在离心管中依次加入 0.5 mL 的体积分数为 2% SRBC 细胞悬液和 10%补 体，另设不加补体的空白对照管，置于 37℃水浴 中温育 1 h ，3 000×g 离心 10 min ，取上清液于 413 nm 处检测吸光值。 1.3.5.6 足趾增厚法检测迟发型变态反应（DTH ）使用体积分数为 2%SRBC 腹腔注射免疫四天后测 量左后足趾厚度，然后再测量部位皮下注射体积分 数为 20% SRBC ，注射 24 h 后测量左后足趾厚度，同一部位测量 3次，取平均值。以攻击前后足趾的 厚度差表示 DTH 的程度。 1.4 数据处理 所有测试平行重复 3次，结果以 X ±S 表示。采用 SPSS 22.0软件对实验结果进行统计学处理，使用单因素方差分析（ANOVA ）和 Duncan 多重比 较判断组间差异的显著性，以不同字母表示组间有 显著差异（P ＜0.05）。 2 结果与分析 2.1 等边浅蛤肉基本营养成分及蛋白质氨基酸组 成分析 等边浅蛤肉基本营养成分含量（干基）如表 1所示，其粗蛋白占 53.80%，略高于文蛤（51.53%）和近江牡蛎（50.63%）；粗脂肪含量占 1.88%，明显 低于文蛤（6.78%）与近江牡蛎（6.95%）[20-21]。可 见，等边浅蛤是一种高蛋白低脂肪的水产品。 表 1 等边浅蛤肉基本营养成分分析（干基） Table 1 Analysis of basic nutrient components of Gomphina aequilatera (dry weight) % 粗蛋白 粗脂肪 灰分 总糖 非蛋白氮 53.80 ± 0.036 1.88 ± 0.055 18.37 ± 0.082 17.48 ± 0.003 12.77 ± 0.079 注：试验数据以平均值士标准差 (Mean ± SD)表示。 Note: the test data are expressed as Mean standard deviation (Mean ± SD). 由表 2可知，等边浅蛤检测的 16种氨基酸中 谷氨酸含量高最高，天冬氨酸次之，精氨酸、亮氨酸、甘氨酸、赖氨酸和丙氨酸含量也比较高，其中人体 必需氨基酸含量较高，占总氨基酸比例为 35.17%。谷氨酸和天冬氨酸不仅是鲜味氨基酸，还是脑营养 剂，是人类消耗大最大的氨基酸，能够促进神经细胞 兴奋，对大脑功能和中枢神经系统的正常活动具有 重要意义 [22]。有研究表明，补充外源性谷氨酰胺能 有效预防运动导致的免疫抑制 [23]。精氨酸能够保护 胸腺、提高巨噬细胞的活性和对肿瘤细胞的杀伤功 能、刺激机体 IL-2升高和抑制肿瘤细胞的生长 [24]。 表 2 等边浅蛤蛋白质的氨基酸组成 Table 2 Amino acid composition of Gomphina aequilatera % 氨基酸种类 氨基酸质量分数 氨基酸种类 氨基酸质量分数 天冬氨酸(Asp) 5.1 蛋氨酸(Met*) 1.24 苏氨酸(Thr*) 2.15 亮氨酸(Leu*) 3.47 丝氨酸(Ser) 2.24 酪氨酸(Tyr) 1.81 谷氨酸(Glu) 7.49 苯丙氨酸(Phe*) 1.77 甘氨酸(Gly) 3.4 组氨酸(His) 1.07 丙氨酸(Ala) 3.25 赖氨酸(Lys*) 3.37 缬氨酸(Val*) 2.21 精氨酸(Arg) 3.83 氨基酸总和 wTAA 46.14 脯氨酸(Pro) 1.73 必需氨基酸与 wTAA比值 35.17 碱性氨基酸与 wTAA比值 17.92 疏水性氨基酸与 wTAA比值 38.7 支链氨基酸与 wTAA比值 16.69 注：*为必需氨基酸。表中疏水性氨基酸含量是指 Phe 、Val 、Leu 、Ile 、Pro 、Ala 、Gly 7种氨基酸总和占氨基酸总量的值；碱性氨基酸含量是指 His 、 Arg 、Lys 3种氨基酸总和占氨基酸总量的值 ;支链氨基酸含量是指 Val 、Leu 、Ile 3种氨基酸总和占氨基酸总量的值。 Note: essential amino acid marked with *. The hydrophobic amino acid content in the table refers to the total amino acid content of Phe, Val, Leu, Ile, Pro, Ala and Gly. Basic amino acid content refers to the total amino acid value of His, Arg and Lys. Branched chain amino acid content refers to the total amino acid content of Val, Leu and Ile. 2.2 等边浅蛤肉酶解产物超滤组分的体外免疫活 性评价 2.2.1 对小鼠 RAW264.7细胞增殖能力的影响 巨 噬细胞是体内主要抗原递呈细胞，在机体中不仅执 行非特异性免疫应答的效应功能，而且通过递呈抗 原启动特异性免疫应答 [25]。因此，本实验采用 RAW264.7小鼠单核巨噬细胞模拟体内巨噬细胞参 与免疫调节过程。如图 1所示，在质量浓度为 50 ~1000μg/mL 的范围内等边浅蛤肉酶解产物的＞3ku 和＜3 ku 这两个超滤组分对 RAW264.7细胞增殖 作用，均呈现先上升后下降趋势，且均在质量浓度 为 250 μg/mL 时具有大最大值，其中＜3 ku 超滤组分 的相对增殖率为 126.22%（P ＜0.05）。与 LPS 阳性 对照组相比，＞3 ku 超滤组分仅在质量浓度为 250μg/mL 时，对 RAW264.7细胞的增殖作用更显著（P ＜0.05）。而＜3 ku 超滤组分在质量浓度为 50、100、250及 500 μg/mL 时均显著高于＞3 ku 超滤组分及 LPS 阳性对照组。说明等边浅蛤肉酶解产物的＞3ku 超滤组分各质量浓度对 RAW264.7细胞无毒性，且能不同程度地促进细胞生长和增殖作用。根据研 究表明 [26]绿豆肽可促进 RAW264.7巨噬细胞的增 殖。与绿豆肽比较，等边浅蛤酶解产物超滤组分对 于增强 RAW264.7巨噬细胞的增殖作用有较好效 果。 质 量 浓 度 /( ug/mL ) 凡含一个相同字母者表示差异不显著（P > 0.05） The data with a same letter mean no significant difference at 0.05 level 图 1 不同质量浓度对 RAW264.7细胞增殖能力的影响 Fig. 1 Effects of different mass concentrations on the proliferation of RAW264.7 cells 2.2.2 对小鼠 RAW264.7细胞吞噬中性红能力的影 响 活化巨噬细胞显最显著的特征之一是吞噬作用 激增，这是巨噬细胞对病原体和癌细胞反应的第一 步，也是至关重要的一步 [27]。如图 2所示，随着质 量浓度增加，两个超滤组分对 RAW264.7细胞吞噬 中性红能力均呈现先上升后下降趋势，在质量浓度 为 250 μg/mL 时达到大最大值，且＜3 ku 超滤组分效 果好最好。在质量浓度为 100、250及 500 μg/mL 时，＜3 ku 超滤组分的吸光值均显著高于＞3 ku 超滤组 分（P ＜0.05）。与阳性对照组相比，＞3 ku 超滤组 分在质量浓度为 250 μg/mL 时与 LPS 对照组无显著 性差异，其余情况均低于阳性对照组。＜3 ku 组分 在质量浓度为 250 μg/mL 时对 RAW264.7细胞的吞 噬作用均显著高于 LPS 阳性组（P ＜0.05），且在质 量浓度为 100及 500 μg/mL 时，与 LPS 阳性对照组 无统计学差异（P ＞0.05）。与韦懿芳等 [28]实验结果 相比，等边浅蛤肉酶解产物的超滤组分促进 RAW264.7细胞吞噬抗原的能力更好，说明＜3ku 超滤组分能有效促进 RAW264.7细胞吞噬抗原。研 究人员发现，文蛤 [8]、牡蛎 [12]、青蛤 [29]中存在小 分子肽能促进巨噬细胞吞噬活性。有文献报道 [30]巨噬细胞的非炎性吞噬作用受到抗炎细胞因子的 调控。因此，＜3 ku 超滤组分可能是通过抗炎因子 对巨噬细胞的吞噬作用进行调控。 质 量浓度/ (ug/mL ) 凡含一个相同字母者表示差异不显著（P > 0.05） The data with a same letter mean no significant difference at 0.05 level 图 2 不同质量浓度对 RAW264.7细胞噬能力的影响 Fig. 2 Effects of different mass concentrations on the phagocytosis of RAW264.7 2.3 等边浅蛤肉酶解产物超滤组分体内免疫活性 评价 2.3.1 对小鼠碳廓清实验及 NK 细胞活性的影响 巨噬细胞是一类非特异性免疫细胞，活化后可通过 对异物的吞噬、向机体免疫系统提呈抗原以及释放 炎性细胞因子，清除病原微生物与衰老细胞，促进 炎症反应，诱发特异性免疫反应，在非特异免疫中 起重要作用，因此可以通过单核吞噬细胞的吞噬指 数及 NK 细胞活性指标来评价等边浅蛤肉酶解产物 超滤组分对小鼠非特异性免疫的影响 [31]。如图 3A 所示，与空白组相比，阳性组、酶解产物及两超滤 组分的高、中、低剂量组的吞噬指数均显著高于空 白组（P ＜0.05），且＜3 ku 超滤组分的高剂量组吞 噬指数大最大，说明＜3 ku 超滤组分能有效提高体内 碳颗粒被清除的速率，且呈现剂量效应关系。NK 细胞活性实验中，如图 3B 所示，与空白组相比，阳性组、酶解产物及两超滤组分的高中低剂量组均 显著高于空白组（P ＜0.05），且＜3 ku 超滤组分中 剂量组的 NK 细胞活性大最大，说明＜3 ku 超滤组分 能有效提高 NK 细胞的活性。因此，酶解产物及两 个超滤组分都能提高小鼠机体非特异性免疫功能，但＜3 ku 超滤组分效果明最明显。NK 细胞的功能是 由 NK 细胞自身以及其他细胞如 T 细胞和单核吞噬 细胞共同产生的免疫调节细胞因子介导和调节的。 IL-2和 IFN-γ 是介导 NK 活性重最重要的细胞因子 [32]。因此，等边浅蛤肉酶解产物超滤组分可能是通过调 控 NK 细胞本身和单核吞噬细胞等分泌 IL-2和 IFN-γ 等细胞因子来提高 NK 细胞的免疫能力。 凡含一个相同字母者表示差异不显著（P > 0.05） The data with a same letter mean no significant difference at 0.05 level 图 3 不同组分对单核吞噬细胞吞噬指数（A ）和 NK 细胞活性（B ）的影响 Fig. 3 Effects of different components on the phagocytosis index of mononuclear phagocytes(A) and NK cell activity(B) 2.3.2 对血清溶血素含量及抗体生成细胞数的影 响 体液免疫是通过 B 淋巴细胞介导产生抗体来 达到保护目的的免疫机制。SRBC 免疫小鼠后，B 淋巴细胞分泌溶血素，血清中溶血素的含量和抗体 生产细胞数量可用于评估体液免疫功能的状态 [33]。一般用半数溶血值来表示血清溶血素的含量，如图 4A 所示，与空白组相比，阳性组、酶解产物及两 个超滤组分的高、中、低剂量组均显著高于空白组 （P ＜0.05），且＜3 ku 组分的中、高剂量组半数溶 血值大最大，说明＜3 ku 组分的中、高剂量组能够有 效促进浆细胞分泌抗体。抗体生成细胞的数量通过 定量溶血分光光度计法检测，如图 4B 所示，与空 白组相比，阳性组、酶解产物及两超滤组分的高、中、低剂量组均显著高于空白组（P ＜0.05），其中 ＜3 ku 超滤组分低、中剂量组的抗体生成细胞多最多，说明该组份能有效促进小鼠机体的 B 细胞分化为浆 细胞。因此，酶解产物及两超滤组分都能提高小鼠 机体特异性免疫中的体液免疫功能，但＜3 ku 超滤 组分效果明最明显。 剂 量 /(mgkg-l -d-l ) 凡含一个相同字母者表示差异不显著（P > 0.05） The data with a same letter mean no significant difference at 0.05 level 图 4 不同组分对抗体生产细胞数量的影响（A ）和 不同组分对血清溶血素的影响（B ） Fig. 4 Effect of different components on the number of cells producing antibodies(A) and serum hemolysin(B) 2.3.3 对小鼠迟发型变态反应的影响 检测迟发 型变态反应程度（DTH ）可以评估小鼠机体特异性 免疫中的细胞免疫的影响，DTH 一般用被攻击部位 的肿胀程度来表示 [34]。如图 5所示，与空白组相比，阳性组、酶解产物及两个超滤组分的高中低剂量组 的足趾厚度差值均显著高于空白组（P ＜0.05），且 ＜3ku 超滤组分的高中低剂量组足趾厚度差值最最 大，无显著性差异。说明＜3ku 超滤组分可有效促 进小鼠机体 T 细胞分化为效应 T 细胞。李婉等 [12]在对牡蛎免疫活性成分研究中发现，牡蛎的酶解产 物超滤组分能够增强正常小鼠的 DTH ，有效增强由 T 淋巴细胞介导的特异性免疫反应。而 Yu 等 [6]对青 蛤中的多肽对免疫缺陷小鼠的免疫增强作用研究 中发现，SCSP 可增强免疫抑制小鼠的细胞免疫功 能，调节 T 淋巴细胞亚群的异常分布并改善免疫受 损小鼠的细胞免疫状态。因此，等边浅蛤肉酶解产 物及两个超滤组分能提高小鼠机体特异性免疫中 的细胞免疫功能，尤其＜3 ku 超滤组分效果较明显。 凡含一个相同字母者表示差异不显著（P > 0.05） The data with a same letter mean no significant difference at 0.05 level 图 5 不同组分对小鼠迟发型变态反应的影响 Fig. 5 Effects of different components on delayed allergy in mice 3 结论 等边浅蛤具有高蛋白低脂肪的特点，其氨基酸 种类和含量丰富，且谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸等 与免疫功能有关的氨基酸含量丰富。细胞实验表 明，等边浅蛤肉酶解产物＜3 ku 超滤组分具有增强 巨噬细胞增殖和吞噬作用，有增强非特异性免疫反 应的潜力。动物实验表明，等边浅蛤肉酶解产物＜3 ku 超滤组分能增强肝单核巨噬细胞的吞噬作用，促进 NK 细胞活性、抗体生成、抗体产生细胞生成 和迟发型超敏反应，有增强特异性免疫反应的潜 力。因此等边浅蛤酶解产物的＜3 ku 超滤组分具有 较强的免疫调节作用。 参考文献 [1] 刘国栋 ,王桦 ,汪琦 ,等 .四大类主要慢性病流行现状 与应对策略 [J].中国社会医学杂志 , 2017(1): 53-56. 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