实验方案：基于微流控芯片制备核酸脂质纳米颗粒（mRNA-LNP合成为例）（附：LNP合成质量检测、转染细胞等实验方案）（2）

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接上一篇内容 （受平台编辑器字数限制，分2篇完成）https://www.instrument.com.cn/netshow/SH111222/s955613.htm实验方案：使用Qubit测定LNP包封率及利用率实验目的对制备的 LNP 包封 mRNA 的效果进行测定。实验试剂实验耗材实验仪器Qubit 4.0 Invitrogen实验步骤检测步骤可参考Qubit™ RNA HS Assay Kit 说明书：Document Connect (thermofisher.cn)操作步骤简述如下：1）配制RNA检测工作液：吸取 [(样品数)+( 2 标曲)+( 1 )] μl的Qubit™ RNA HS reagent，加入200 ×（[(样品数)+( 2标曲)+( 1 )] μl的Qubit™ RNA HS buffer，配成1:200比例配置工作液。【如6个待测样本，吸取（6+2+1）= 9 μl的Qubit™ RNA HS reagent，加入200 x (6+2+1) μl = 1800 μl的Qubit™ RNA HS buffer中配成工作液。】2）制作常规标曲，并于Qubit 4.0上进行标曲的校准。3）检测LNP合成终产物中，游离RNA含量。【若浓度过低无法检测，则吸取190μl工作液，加入10μl待测样本，充分混匀后检测。在Qubit 4.0中选择1μl选项,并随后将数值x10，进行10倍换算。】4）使用TE buffer或DEPC水配置 4 % Triton X-100，与LNP终产物1:1混合（5μl+5μl即可）。使用该终浓度为 2 %的Triton X-100破乳5分钟。5）在常规标曲中添加 1 μl的 2 % Triton X-100，并于Qubit 4.0上进行含有Triton X-100新标曲的校准[3]。6）测量LNP破乳后的RNA浓度。【注意该RNA溶液在破乳时稀释了1倍。真实浓度需要 × 2。】7）进行包封率的计算，公式为：载药量 = 破乳后读值 - 破乳前读值包封率(%) = [载药量/破乳后读值] × 100%8）同时可进行RNA利用率的计算，公式为：RNA利用率 (%) = [载药量/RNA投入量] × 100 %【3】经检测，Triton X-100的存在会影响RNA检测的准确度, 故推荐制作新标曲。实验方案：使用酶标仪测定LNP包封率实验目的对制备的 LNP 包封 mRNA 的效果进行测定。实验原理Quant-iT™ RiboGreen® RNA 试剂是一种超灵敏的荧光核酸染色剂 ，可检测溶液中 1-200 ng 的核酸 ，这种核酸染料无法透过 LNP ，因此只有游离的未被 LNP 包载的核酸可 以被结合。Triton-100 作为一种表面活性剂常被用做破乳剂，使用 1%的 Triton-100 处理 获得的 LNP-mRNA 可以使包载的核酸释放 ，得到总核酸量。通过计算破乳前后核酸量的差异得到载药量 ，再除以总核酸量即可得到包封率 ，即：包封率（%） =（破乳后定量-破乳前定量）/破乳后定量实验材料Quant-iT™  RiboGreen™  RNA 检测试剂盒（Thermo Fisher ， R11490）Triton™ X-100   （ SIGMA-ALDRICH ，T8787-100ML）DEPC 水CellCarrier-96 Ultra Microplates （ PerkinElmer ， 6055308）实验步骤试剂准备等检测步骤细节可参考Quant-iT™ RiboGreen® RNA 试剂盒说明书。1） 将 20xTE 用 DEPC 水稀释至 1x；用稀释好的 1XTE 稀释试剂盒中的标准品，稀释成 2  μg/mL 及 100 ng/mL 两种终浓度； 2） 用 1xTE 稀释试剂盒中的 QuantiT™  RiboGreen® Reagen，稀释成 200 倍及 2000倍两种终浓度；注意要同时制作含有/不含有Triton X-100的两套标曲；按照下表在 CellCarrier-96 Ultra Microplates 中加入以下试剂 ，做复孔：High rangeLow range3） LNP 破乳。将 Triton-100 用 1xTE 稀释到 2 %，取 100  μl 加入 CellCarrier-96 Ultra Microplates， 加入  1  μl 制备好的 LNP，处理  5 分钟，加入 100  μl  200-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent。4) 4. LNP 游离核酸测定。在 CellCarrier-96 Ultra Microplates 中加入 100 ul 1xTE ，取 1 μl 制备好的 LNP 加进去 ，混匀 ，加入 100  μll2000-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent。5）读板使用 SPARK 读取荧光强度 ，激发光设置为 480 nm ，发射光为 520 nm6. 数据处理6） 标曲制备7） 样品定量载药量 =破乳后读值-破乳前读值包封率（%） =载药量/破乳后读值8）同时可进行RNA利用率的计算，公式为：RNA利用率 (%) = [载药量/RNA投入量] × 100%实验方案：mRNA-LNP转染293T细胞实验目的以 293T 细胞为例 ，使用包封了 EGFP-mRNA 的 LNP 对细胞进行转染。实验步骤1．HEK-293T 细胞消化。选取 P3 – P15之间的HEK-293T细胞[4]。弃上清后PBS清洗。1 ml 胰酶37℃消化1min。使用1 ml 含10 % FBS的DMEM终止消化。轻柔吹打细胞，收集细胞悬液。2．细胞铺板室温125 x g，离心5~10 min。弃上清，并以3ml，noPS，10 % FBS的DMEM重悬细胞。对细胞进行计数。取5 x 104 个细胞/24孔板单孔铺板。每个孔中添加 1 ml noPS , 含10 % FBS的DMEM培养基。3．细胞转染可用lipo作为阳性对照进行转染实验。对于LNP转染，直接加入包封完成的EGFP-mRNA-LNP即可。每孔添加500ng。若使用其他规格培养皿或培养板，保证包封在LNP内的EGFP-mRNA-转染量达到终浓度500ng/ml即可。培养24h后即可观察到荧光。若mRNA-LNP浓度较高，可在转染前使用opti-MEM对LNP进行稀释或定容。4．检测在 转染48 小时后 ，收集细胞 ，流式检测 GFP 信号阳性率。细胞转染结果见 附录-附件5[4].大量的实践结果表明，293T细胞被支原体感染后，虽不影响Lipo-mRNA的转染，却会*大降低mRNA-LNP的转染效率。这会导致阳性对照正常，转染实验组无表达。请在转染前，务必进行细胞支原体检测，确保细胞的状态。附录附件清单附件1：复方磷脂浓度与粒径/PDI的关系图；附件2：LNP合成总流速与LNP粒径/PDI的关系图；附件3：乙醇浓度对LNP粒径及PDI检测的影响；附件4：LNP合成超滤与不同条件透析对比附件5：mRNA-LNP转染HEK-293T附件1：复方磷脂浓度与粒径/PDI的关系图实验条件： 仪器：Fluidiclab-S1 ；芯片：Fluidiclab-B1MC3复方脂质配方；总流速：12 ml/min；流速比（脂相：水相）= 1 : 3；前废液0.2 ml；LNP空包无mRNA；初产物未经过柠檬酸缓冲液稀释。可见12 mM合成粒径*小。附件2：LNP合成总流速与LNP粒径/PDI的关系图实验条件：仪器：Fluidiclab-S1 ；芯片：Fluidiclab-B1MC3配方：12 mM浓度；流速比（脂相：水相）= 1 : 3；前废液 0.2 ml；LNP空包无mRNA；初产物经柠檬酸缓冲液稀释5倍后检测；可见速度越高合成LNP粒径越小。附件3：乙醇浓度对LNP粒径及PDI检测的影响LNP越稀释粒径越小？LNP全称Lipid Nanopartical（纳米脂质颗粒）。常用LNP合成仪，利用微流控的方式在微流控芯片中进行高度可控的合成。LNP合成后，有一些老师发现使用马尔文粒度仪测量LNP粒径时，对LNP产物做了稀释的粒径小于LNP产物直接进行检测。这是怎么回事呢？众所周知，马尔文粒度检测仪对于粒子粒径大小的检测基于粒子的布朗运动速率。所以液体的折射率/粘度等参数都会对检测结果有所影响。这也是在进行粒度检测之时需要选择粒子所在溶液及液相参数的原因。那不禁想问，LNP合成后所残存的乙醇是否对LNP粒径和PDI有影响？产物直接做检测是否得到的是真实的粒径？为了回答这些问题，我们进行了一系列验证实验。25%乙醇会显著增加粒径的检测值一般LNP合成时，有机相（溶解了脂质的乙醇）：水相（溶解了mRNA的柠檬酸钠缓冲液）的流速比为1：3。这就使得产物会有25%的乙醇。为了模拟这个乙醇浓度，我们在标准品70nm的单分散交联聚苯乙烯标准微球（即70nm PS微球）中加入了25%乙醇进行检测。与原始溶液中的标准微球相比，添加终浓度25%乙醇后，检测到的粒径值接近130nm，几乎是原始粒径的一倍（图1.A）；而相比之下，添加终浓度为25%的柠檬酸钠缓冲液中微球粒径和PDI与原始检测结果并无差异（图1.A）。图1：标准微球的乙醇稀释实验。A：终浓度为25%的柠檬酸缓冲液和25%的乙醇对70nm标准微球的稀释测量结果；B：标准微球的二度稀释实验。Error bar为样本标准差；N.S：无显著差异；检验方式：Student’s t-test。乙醇改变粒径检测值而不改变其实际大小熟悉材料学的朋友可能会提出异议，PS是会被乙醇降解的。这个结果是否是由于乙醇将PS微球溶解从而导致检测粒径增大呢？为了回答这个问题，我们将上一步实验得到的包含PS微球的25%的乙醇溶液再次进行了稀释，将乙醇浓度降低至5%。结果发现，检测粒径重新变小，，且与直接加入5%的乙醇相比，粒径数值没有显著差异（图1.B）。粒径可能被溶解从而增大，但并不会自发缩小。该结果可以认为，粒径数值上的改变完全是因为乙醇浓度造成的影响。推荐LNP合成后进行5倍稀释（检测时，乙醇终浓度≤5%）意识到乙醇的存在会对粒径检测产生剧烈影响，那究竟在LNP合成后，稀释多少倍进行检测比较合适呢？我们在标准微球中加入了1%~25%的乙醇进行了反复测试，观察乙醇对粒径测量的影响。结果发现，即使2%的乙醇即可使得粒径测量值有着显著的增加（图2）。并且随着乙醇浓度的逐渐增加，标准微球的测量数值逐渐增加。但是根据图1.B的结果我们可以知道，这仅仅是检测数值的变化，并非粒子真实的粒径改变。大家可以根据实际需要，参考我们的结果，进行LNP合成溶液的稀释和粒径检测。图2：70nm PS微球的梯度稀释实验。Error bar为样本标准差；N.S：无显著差异；检验方式：Student’s t-test。虽然乙醇浓度越低越接近真实的粒径值，但是我们仍推荐将乙醇浓度降低至5%附近进行检测。不做进一步稀释的原因是，过高的稀释倍数会导致溶液环境的剧烈变化。尤其是高倍的PBS稀释，会剧烈改变溶液的pH值。这将直接导致粒子电位的剧烈变化，从而使得LNP变得不稳定，PDI异常增大（图3）。过大的稀释倍数也会同时使得LNP粒子浓度的下降，这将会大大增加马尔文粒度检测仪的检测时长，降低精准度。5倍左右的稀释既可以保证与真实粒径的差异在15%以内，且PDI不会有剧烈波动。图3：LNP稀释倍数与粒径/PDI的关系。LNP合成条件：脂相： Alnylam配方（Dlin-MC3-DMA/DSPC/cholesterol/PEG-2000-DMG=50/10/38.5/1.5，mol/mol），12mM脂质总浓度；水相：柠檬酸缓冲液（50mM柠檬酸+50mM柠檬酸钠，pH=4.0）,无mRNA；脂:水FRR（流速比）=1:3；总流速=12ml/min。使用仪器：FluidicLab（上海澎赞生物）LNP智能合成仪-S1。芯片：FluidicLab（上海澎赞生物）B1（鱼骨）芯片。附件4：LNP合成超滤与不同条件透析对比实验条件：仪器：Fluidiclab-S1 ；芯片：Fluidiclab-B1MC3配方：12 mM浓度；流速比（脂相：水相）= 1 : 3；前废液 0.2 ml； LNP空包无mRNA；合成初始——初产物经柠檬酸缓冲液稀释5倍后检测；超滤使用Millipore 15ml/30 kd 超滤离心管(外径50ml尺寸)[UFC903096]。透析使用Thermo Scientific™ Slide-A-Lyzer 透析盒 (20K MWCO)[66003]。超滤后浓缩则使用[66003]透析盒后再使用[UFC903096]进行浓缩。实验步骤参照第一节：《实验方案：微流控混合方式制备包裹mRNA的脂质纳米颗粒（mRNA-LNP的制备）》。附件5：mRNA-LNP转染HEK-293T实验条件：见：第5节：《实验方案：mRNA -LNP转染293T细胞》。