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菌种衰退还有以下几种原因: 1、表型延迟造成菌种衰退 表型延迟现象也会造成菌种衰退。如,在诱变育种过程中,经常会发现某菌株初筛时产量较高,进行复筛时产量却下降了。 2、质粒脱落导致菌种衰退 质粒脱落导致菌种衰退的情况在抗生素生产中较多,不少抗生素的合成是受质粒控制的。当菌株细胞由于自发突变或外界条件影响(如高温),致使控制产量的质粒脱落或者核内DNA和质粒复制不一致,即DNA复制速度超过质粒,经多次传代后,某些细胞中就不具有对产量起决定作用的质粒,这类细胞数量不断提高达到优势,则菌种表现为衰退。 3、连续传代 连续传代是加速菌种衰退的一个重要原因。一方面,传代次数越多,发生自发突变(尤其是负突变)的几率越高;另一方面,传代次数越多,群体中个别的衰退型细胞数量增加并占据优势越快,致使群体表型出现衰退。 4、不适宜的培养和保藏条件 不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重要原因。不良的培养条件如营养成分、温度、湿度、pH值、通气量等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等,不仅会诱发衰退型细胞的出现,还会促进衰退细胞迅速繁殖,在数量上大大超过正常细胞,造成菌种衰退。 那么我们应该如果避免菌种衰退呢? 1、控制传代次数 尽量避免不必要的移种和传代,把必要的传代减少到最低的水平以减少突变几率。传代次数越多,产生突变的几率就越大,菌种发生衰退的机会就越高。在实验室检验或者是生产实际中,应严格控制传代次数。中国药典当中规定,培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代,以防止菌株因传代次数过多引起衰退影响检验。 2、利用不同类型细胞进行接种传代 放线菌,霉菌用菌丝进行移种比分生孢子容易衰退,因菌丝是对核且有异核存在,所以移种霉菌适宜采用孢子。 3、良好的培养条件 不良的培养条件会衰退细胞的出现,因此采用适宜的培养基进行菌种培养,以减少衰退几率 4、采用有效的菌种保藏方法 根据保存时间的长短,选择适宜的保存方法。 传代培养法:复苏后的第一代放于4℃冰箱或室温保存,定期传代培养。保藏时间依微生物种类而定。如,芽孢、霉菌、酵母菌保存6个月转一次,普通细菌1个月转一次,假单胞菌2周转一次。 甘油冻存法:将复活后经过性能确认的菌株新鲜培养物(一般是第二代菌株),用0.85%的灭菌生理盐水(约1-2mL)洗斜面菌苔成菌悬液;将上述菌悬液吸取适量于灭菌管(冻存管)中(如,灭菌管容量为5ml,则取1.5mL菌液),加入等体积的40%灭菌甘油,混匀,密封。保藏温度为—20℃,一般可保存1-2年。 瓷珠保存管保存:菌株保藏管内含特制的小珠(20-25颗)和特殊溶液,只需将培养好的菌株接入溶液中,摇匀成菌悬液,细胞即吸附于小珠上,然后吸出溶液,将保藏管置-70℃可保存5年,置-20℃可保存2-3年。
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