bradford法测蛋白浓度误差原因分析

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　　考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595 nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比。　　　　该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂对测定有干扰。缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。　　　　Bradford法（考马斯亮蓝法） 实验原理：　　　　Bradford蛋白质测定法是根据蛋白质与染料结合的原理设计的。考马斯亮蓝染料（G-250）在酸性溶液中与蛋白质的碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基结合，使得染料的最大光吸收峰位置由原来的465nm变为595nm，溶液颜色也由原来的棕红色变为蓝色，反应迅速且稳定，形成的化合物颜色深浅在一定范围内与蛋白质浓度成正比关系，因此可通过测定结合染色后溶液在595nm处的光吸收度值来计算溶液中蛋白质的含量。　　　　Bradford法测蛋白浓度‌的误差主要来源于几个方面：　　　　‌1.样品稀释倍数的影响‌：当样品浓度较低时，读数的轻微波动会导致浓度测定的较大偏差。例如，如果浓度较高，读数从0.31波动至0.33，这对最终浓度影响不大；但如果浓度很低，读数从0.07波动至0.09，这一波动对蛋白浓度的测到值却有很大影响，分别达到0.14和0.18，误差高达30%左右‌1。　　　　‌2.标准曲线和线性范围‌：只有在一定范围内，测定值才处在线性范围内。浓度太低或太高时，测定值都会有偏差。因此，建议在较高蛋白浓度条件下测定蛋白，以此为准进行稀释，不需要对稀释后的蛋白再次测定‌。　　　　‌3.染料与蛋白质结合的过程‌：虽然染料与蛋白质结合的过程只需要2min，复合物的颜色在1h内保持稳定，但标准曲线的轻微非线性以及染料与蛋白质反应的竞争性抑制（如盐酸胍、抗坏血酸等化合物的影响）也可能导致测量误差‌23。　　　　‌4.实验操作和仪器的影响‌：实验过程中的操作误差，如样品稀释、标准曲线的制备、吸光度的测量等，都可能引入误差。此外，使用的检测器皿类型、清洁度以及检测时的温度等因素也可能影响结果的准确性‌。　　　　综上所述，Bradford法测蛋白浓度的误差来源多样，包括样品稀释倍数、标准曲线的线性范围、染料与蛋白质的结合过程以及实验操作和仪器的影响。　　　　为了减少误差，应在较高蛋白浓度条件下进行测定，并注意实验操作的规范性和仪器的准确性‌。