C18柱在黄酮类化合物的分离纯化应用

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C18柱在黄酮类化合物的分离纯化应用         ——漆黄素、山奈酚、槲皮素、芦丁和杨梅苷的分离纯化摘要：研究表明黄酮类化合物中有重要生物学和药用价值的化合物很多。常见的黄酮醇对抗糖尿病、癌症、心血管疾病以及病毒和细菌疾病方面发挥着重要的作用。例如向天果中的芦丁，能够改善血管的通透性、降低血脂和胆固醇，用于防治老年高血压和脑溢血；银杏叶中含有的槲皮素，具有抗肿瘤活性、抗氧化和抗过敏等特性；山柰酚等具有抗病毒作用。随着现在科技的发展，工艺条件不断的改善，更多的黄酮类化合物被提取出来，广泛用于药品开发以及功能性食品中，极大的推动我国医药领域以及食品行业的发展。目前黄酮类化合物的开发提取已成为国内外天然药物领域以及保健品行业开发利用研究的热点。黄酮类化合物广泛存在于自然界的植物中，属植物次生代谢产物，已知化合物种类高达有9000多种。根据三碳键结构的氧化程度，B环的连接位置等特点，黄酮类化合物可以分黄酮、黄酮醇、黄烷酮、异黄酮、橙酮等十几个类别。本次应用案例为黄酮醇类化合物的分离纯化方法分享，化合物的结构式如图1。三泰的应用工程师使用SW-8201-025-IR无定形C18配合快速液相制备系统SepaBeanTM  machine Ⅱ 成功对五种黄酮醇类化合物进行了分离。图1. 5种黄酮类化合物的结构式示意图（化合物依次为漆黄素、山奈酚、槲皮素、芦丁和杨梅苷。）实验部分1、样品准备称取芦丁、槲皮素和漆黄素各0.2g，杨梅苷和山奈酚各0.1g，加入20 mL 80%的甲醇水溶液进行溶解，得到样品溶液。2、分离制备取配置好的样品溶液经过0.45μm微孔滤膜过滤后直接上样，色谱柱使用25g规格色谱柱分离制备。实验参数如表1所示：表1. 样品的Flash制备实验参数仪器SepaBeanTM  machine U200色谱柱25 g SepaFlash® 反相分离柱(无定形C18, 40-63μm, 60 Å, 订货号：SW-8201-025-IR)检测波长254nm     360nm流动相A：0.4%磷酸水，B：甲醇流速25 mL/min进样量0.5mL洗脱梯度时间（min)流动相B (%)0-5255-2525-5025-3550收集方式阈值收集（阈值10mAU）                                                                                          图2. 5种黄酮类化合物的Flash制备纯化图谱图3. 纯化后化合物定位（使用Web端谱图叠加功能）结果与讨论使用SW-8201-025-IR无定形C18配合SepaBeanTM  machine Ⅱ 成功对5种黄酮醇类化合物漆黄素、山奈酚、槲皮素、芦丁和杨梅苷得到了有效的分离，其中漆黄素和山奈酚为同分异构体。根据SepaBeanTM  machine Ⅱ 仪器独特的色谱峰展示功能：分离谱图中，不同的组分对应不同的颜色。从图2中的颜色展示可以清晰的看出，5种得到了有效的分离。根据SepaBeanTM  machine Ⅱ 仪器独特的色谱峰处理功能：阈值收集融合峰判断。实验过程采用阈值收集，在合适的阈值收集条件下，融入峰判断进行切管，既可以减少样品损失，还可以避免峰与峰之间交叉污染。根据SepaBeanTM  machine 仪器的Web谱图叠加功能：无需导出或借助第三方软件，可以快速对目标化合物进行定位。通过谱图叠加功能，从图3中可以看出，漆黄素、杨梅苷组分对应的出峰时间。此功能在方法开发过程中，可以更快的查看色谱峰间的分离度差异。另外Web端软件支持纯化记录原始数据Excel表导出功能，方便后续第三方软件数据处理作图。