化学分析样品制备(11)
第一章 样品制备的基础知识(11) 1.3.5 方法的确认
在要执行一个新的分析方法或一个样品制备技术前,必须进行确认性的研究,在进行确认时要对各种有影响的条件进行测定,测量影响准确度和精密度的随机和系统误差,对每一个被分析的样品要确定其检测限,在方法要求的浓度范围内测定其准确度和精密度,确定动态线性范围和校准灵敏度。一般上,方法的确认要对新方法的优越性进行全面的描述,并对已有的方法进行比较提供根据,一个典型的确认过程包括一个或多个下面的步骤:
* 单一操作员贡献值(single operator figures of merit)。测定准确度,精密度,检测限,线性动态范围,和灵敏度
* 未知样品分析。这一步包括未知浓度样品的分析,定性和定量分析都需要进行,可靠的未知样品来自于商品或政府机构,它们是有证书的参考物质,测定它的准确度和精密度。
* 等效测试 一个方法一经开发出来,一定要和已经有的方法进行对比,进行统计分析用以确定是否已建立的新方法可以给出相同的结果来,典型的统计分析包括用于平均值比较的学生检验,和用于偏差比较的 F-检验。
* 协作测试 一个方法一经在一个实验室进行了确认,这一方法就要进行协作测试,这里要在各个实验室使用同样的样品和操作规程,对所得结果进行统计分析,确定偏差和实验室之间的变动性,这一步骤确定方法的耐用性(ruggedness).
方法的确认决定于分析的目的,例如,对 PCR建议确认的步骤要遵从重组 DNA 测定的凝胶电泳的方法,包括以下的步骤:
1.比较在相似的条件下多次(比如 6 次)单独分析参考标准样品的精密度。
2.分析数据的变异系数必须小于某一定值(比如 10%)。
3. 方法的确认应该分三天进行,在同样的条件下对标准样品做三次重复分析,比较其精密度(再一次接受这一方法的判据就是要符合规定的相对标准偏差)。
4.为了证明这一点,让另外一个分析人员进行这一实验,得到类似的精密度,两个分析人员应当分别独立地进行测量(再接受这一方法的判据就是要符合规定的相对标准偏差RSD)。
5.必须用系列稀释的样品测试检测限、定量限、和动态线性范围,建议在每一个浓度下重复进行三次试验,校准曲线可以接受的标准是达到规定的相关系数(即r2值要等于或大于0.995)
6.分子量标记物必须落到已经建立的迁移时间范围内,分子量标记物落到迁移时间范围以外,必须重复进行凝胶电泳试验。
(资料来源:“Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry“,Editor J. D. WINEFORDNER,2003)