zxhcnf
第1楼2009/12/29
五.咨询月旭工程师后的思路
某日在仪器信息网上闲逛,看到了月旭的这个试用活动,于是填写了申请表,想碰碰运气。结果下午就接到了月旭工程师的电话。在了解了我的样品情况和已经做过的试验之后,月旭工程师给出了这样的建议:1,用不同pH的磷酸盐缓冲液作为流动相;2,不同pH的磷酸盐缓冲液中应用离子对试剂(辛烷磺酸钠);3,换色谱柱,使用月旭公司的AQ柱。整个过程中,月旭工程师的专业知识和良好的态度给我留下深刻印象。第二天,我收到了月旭公司从上海寄过来的色谱柱(真快!),定了药品,准备新的尝试。
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六.同样流动相,两个色谱柱的比较
所有的药品都到齐了之后,配好流动相,我首先在相同流动相的前提下,对两个色谱柱的分离效果进行了比较。结果表明,月旭AQ柱无论在峰型和保留时间上都远好于另一只色谱柱(这里我们认为色谱图中最显著且主要的峰是我要的有效成分,为什么?以为我做了不同分离程度的样品,结果不变的都是这个峰,嘿嘿)。当然,这并不是在比较两个品牌的好坏,因为一个是普通C18,一个是C18 AQ。但是这个比较证明了AQ柱更适合分析我的样品,也就是说AQ柱更适合强极性的样品。
下图是某品牌C18柱色谱图
接下来是Ultimate C18-AQ
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七.确定色谱柱,进行流动相的优化
从上面两柱比较的图可以看到,Ultimate C18-AQ表现良好,特别是在离子对试剂纯在的条件下,分得更开且峰型更好。但是有一个缺点:保留时间太长。所以就要加一些有机溶剂进去,增加洗脱能力,减少保留时间。在月旭工程师的帮助下我选择了乙腈。在上述离子对流动相里添加了10%的乙腈后,保留时间显著缩短,且峰型依然很好。这样最终确定了用于分离的的流动相组成。
下图是加入了乙腈,最终确定的流动相跑出的色谱图
这里有一些小细节。上图中的2,3事实上是同样的流动相(开始我是这么认为的),2是事先把乙腈按比例加到水相里,然后调好pH。3是先调好pH,然后用四元泵将乙腈和水相混合。可以看出3是有明显拖尾的,后来我测了pH才发现3的pH升高了许多。也就是说如果流动相里要加入有机溶剂,特别是在对pH要求较高的时候,不能用四元泵将二者混合,而要事先混合,调好pH,脱气,用泵的一个通道进去。
还有图中的1,这是将2中的pH降低了0.3后得到的色谱图。由图可以看出,。在使用离子对的时候,pH的变化会显得非常敏感。。在这里我将pH优化到2.2,峰的对称性几乎等于1.
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samanthalas
第2楼2009/12/29
八.峰纯度的检验
在上面确定了很好的分离条件之后,有一个问题是必须考虑的:那个看似完美的峰是不是个纯物质形成的呢?要回答这个峰纯度问题,我查到了两种现有条件可行的做法。第一,使用DAD检测器,得到三维的光谱色谱图,利用工作站附带的检验功能检测峰纯度。第二,液质联用,检验峰纯度。对于第一种方法呢,我也没有DAD检测器,而且这种方法也不是很可靠,所以暂时没有考虑。于是决定采用可靠的LC-MS。
这里又碰到一个问题,要想上MS,就不能用离子对把流动相搞得如此复杂。想来想去,又把电话打到月旭工程师那了(真不知道是我在做实验还是月旭工程师在做实验,谁让我是新手呢,呵呵),得到了一个方法。上边比较的图中可以看到,TFA的分离效果也是可以的,如果能确定TFA中的主要峰和离子对中的主要峰是同一个,那么用TFA做液质联用就没问题了。接下来就将我们的分析型液相当半制备用,用来收集和检测,我的做法是这样的:
(1)用离子对试剂的流动相进行分离,估计好时间在管路的出口处收集目标峰
(2)将收集到的馏分用离子对试剂流动相进行检验
(3)吹干得到的馏分,溶于TFA流动相,用TFA流动相进行检测
经过了上面三步,又出现了新的问题:
1.第二张图里,主峰前面还有一些杂峰,如果从我收集的部分来讲,是不可能收集到那的。那为什么会有呢?我猜测原因可能是这样的:我收集了大约3ml馏分,然后用吹风机一顿吹,吹成了几乎干了。(为什么不吹干?因为我怕吹跑了,哈哈)后来又把它溶到0.2ml TFA流动相中,这样事实上里面成分和浓度是有变化的,所以可能产生了一些莫名其妙的峰,因为这并不是很关键,峰值也不高,也没有太在意,如果那位战友有别的见解,请指教!
2.明明是在离子对中的一个峰,到TFA里怎么就变成两个了?这个问题可是很头疼的啊,分析其原因,可能有以下两个:第一,在离子对中的单一峰是假象,事实上就不是一种物质,而是至少两种物质,只不过离子对流动相没有分开,而到TFA流动相中就分开了(在这里不得不提一个问题,就是本底,或者说背景,这也是月旭工程师提醒我的。相对TFA,离子对可以抬高本底。也就是说有些物质虽然在离子对没有峰,但它确实存在,而是被离子对的高本底盖过去了,但是到TFA时本底一降,也就表现出来了)。第二,上面说过了,从3ml的离子对流动相浓缩成0.2ml,事实上浓缩了15倍,在这个过程中辛烷磺酸钠的浓度也极大的提高了。而辛烷磺酸钠在210nm是会有一定吸收的,所以可能有一个峰就是辛烷磺酸钠。(到这了可能有网友问我,那有没有用TFA流动相跑一个离子对流动相的样品呢?答案是有。我吸取了20微升离子对流动相,然后在TFA流动相条件下跑,结果除了一开始的杂峰之外是没有别的峰的,如下图。但是这个“空白对照”可靠吗?事实上也不可靠,因为他的浓度比较低,所以我怀疑它作为对照的可靠性。)
考虑了这两个问题之后呢,我又进行了一个实验。把我的样品用TFA流动相也跑一下,看看是几个峰。(到这不知道是不是有人有点对我的样品糊涂了啊,呵呵。我做以上所有的实验都是用的同样样品,假定他是A,然后把A用离子对流动相分离,收集了目标馏分,然后浓缩,再溶于TFA流动相,现在称它为称为a。所以到现在有两个样品两种流动相)就是A用TFA流动相跑,这个在上面有图的。好了,下面让我们看看这张激动人心的图吧(下图所有样都是TFA流动相)。
从上图可以看出,我的样品(即A)在TFA流动相中相应位置是只有一个峰的,a样品是从A样品来的,但是它在相应位置有两个峰的可能性是不大的,据此推测a样品中出现的那个峰有可能是辛烷磺酸钠。另外图中还有两个“空白对照”,虽然他们没峰,但是因为浓度远远不同,所以我觉得不太可靠。这样呢,上面第二个问题有了一个比较可能的答案了,即多出的一个峰是离子对造成的。(还有从上图看出同样样品的重复性很差,不知道为什么。咨询了工程师,说可能是因为强保留物质造成的,所以就反冲了柱子,不知道能不能解决。)
接下来希望能验证一下这个想法,还想做以下实验:
1.用TFA流动相来跑一下相应浓度的辛烷磺酸钠,来个真正的空白对照。
2.用TFA分离A,然后用离子对流动相分析收集的馏分。
各位大侠网友有什么意见建议?请大家不吝赐教!
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zxhcnf
第3楼2009/12/30
上面实验说明了在验证峰纯度的过程中出现的问题。对于上面的两个峰提出了假设的解释,并设计了新的实验。现在按照前面的设计,这两个实验都做完了,结果是这样的:
1.用TFA流动相来跑一下相应浓度的辛烷磺酸钠,来个真正的空白对照。
我这次把离子对流动相3ml吹成了200ul,即浓缩了15倍。经过TFA流动相检测发现,并没有峰出现。也就是说,前面推测“新出现的峰是由于收集馏分中残留的离子对造成的”是错误的,残留的离子对试剂在TFA流动相中不会出现明显的峰。这样的结果导致上面两个峰的来历变得更难解释了。下边是对比的色谱图。
2.用TFA分离A,然后用离子对流动相分析收集的馏分。
这也就是把前面的实验反过来了,因为TFA收集之后吹干不会有任何残留。结果怎么样呢?先看一个比较色谱图
从图中可以明显的看出与“离子对流动相收集,TFA流动相验证”同样的问题,本来在TFA中收集了一个峰(馏分用同样流动相做了验证,的的确确是收集到了一个峰,色谱图略),换离子对流动相就变成了两个,而即使是原来的样品(即A),在这种流动相中也不会出现两个峰。这回不可能有任何残留问题了,因为TFA是很容易挥发的。那这又是为什么呢?
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能为您提供一点有益的帮助是月旭人共同的心愿,我们为此感到欣慰,谢谢!