乐果
第1楼2010/12/05
实验经验:
1 问: 我想购买waters600用于分析和制备,对于其配备有什么好的建议。
答:可以配一个PDA,另外加一个示差折光410,另外买几根制备柱就可以了。waters600的流速最大为20mL/min,一般可以配20mm ID的制备柱,一次分离10-100mg的样品,如果样品量更大,可以通过配件扩展到45mL/min,使用30mm ID的制备柱。另外为了保证馏分收集的准确性,最好配上Fraction II 馏分收集器。
如果样品数量很大,可以配2767 sample manager和ZQ MS, 同时做自动进样并通过MS或UV信号自动收集馏分。这样可以过夜自动运行。最大通量每天可以处理100-200个样品。
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第2楼2010/12/05
2 问: 如何用制备色谱柱制备低含量的杂质?
制备色谱柱为Zorbax SB-C18 9.4*250mm及gilson馏分收集器,色谱仪为Agilent 1100或LC-6A。想用其制备面积归一化法含量为0.05%左右的杂质,初步提纯后用高分辨的LC-MS进行定性分析。如何设定色谱条件,如流量,进样量,样品的浓度,切割点的设置,是否要浓缩,要求将95%以上的主峰切除。(主峰后有二个杂质靠得很近。)
答:制备用的流动相最好等级高一点,否则流动相中的杂质会影响LC-MS分析;使用馏分收集器时,延迟体积一定要计算精确,检测器的响应时间设到最小,否则都会影响收集的纯度和回收率。制备柱的流速一般与直径的平方成正比,如果4.6mm分析柱流速为1mL/min,9.4mm制备柱用1*(9.4/4.6)2, 大约为4ml/min。进样量设到几个mg应该基本没有过载。进样样品浓度越高越好。假如进样10mg,理论计算0.05%的杂质大约只有5ug,显然浓度太低,最好是多做几次,合并馏分然后浓缩后做LC-MS分析。
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第8楼2010/12/05
7问: 做柱层析时(国产大孔吸附树脂),怎么才能把洗脱液中的树脂残留物处理干净?
答:大孔吸附树脂在上使用前,一般需要进行处理,方法包括用色谱纯的甲醇或乙睛洗到没有吸收;或树脂用乙醇浸泡2天,丙酮浸泡2天,然后用常规的酸,碱洗。再用丙酮回流二小时就可以用了。
8 问:由分析型液相转为制备型液相,其色谱系统需作多大调整?是否可以按照柱体积折算只改变流速?其上样量多大为宜?
答:(1)泵要换,流量要加大,压力可不变或减少;流通池要换体积更大的。
(2)整个系统的管路要更换更粗的,否则压力太大,而且特别容易发生堵塞。对流通池后的管路,最好增加反压调节器,否则管路太短的话,反压小会导致流通池气泡,管路长的话会导致峰展宽。
(3)检测器的响应时间和峰宽要设置合适,否则会导致收集时延迟体积的计算不准
(4)上样量主要根据柱子的大小、样品的浓度、制备是否根据分析条件放大(例如制备柱是否还用分析用填料);一般上样量与柱子直径的平方以及长度成正比。
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第9楼2010/12/05
9 问:流动相中含有盐时,收集液该如何除盐?选用挥发性酸,碱或盐(如醋酸铵)是否会在挥干溶剂或冻干过程中直接除去?
答:一般可以采用离子吸附的办法去掉(可以参考离子吸附有关技术)。但也是稍微麻烦的事情,最好,不加加酸碱盐,如果要加的话最好,要加挥发性的或者对产品或者检测没有干扰的。
可用G25脱盐,它是安马西亚出的一种葡聚糖凝胶。交联度大孔径小,对小分子的无机盐保留较大,而对分子量较大的有机物没有保留从而可以将盐份脱除。另外采用挥发性的酸,碱时,一般会在干燥过程中直接除去,但如果样品也有酸碱性,可能会与这些挥发性酸碱形成一定比例的盐。
10 问:制备型柱子柱压上升 柱效下降 怎么办?
答:对高价值的制备柱来讲,延长柱子寿命是很重要的。一般要注意保护柱子,一般来说,制备柱子一般需要保护柱配套。
下面是可能堵塞柱子的原因
(1) 如果您所分离的样品中杂质较多而您在上样前没有经过过滤(0.45微米),一些颗粒性杂质会积聚在柱头造成柱压升高,
(2) 也有可能是因为您所使用的流动向中含有缓冲盐的原因,结晶或发生化学变化而堵塞。可以把柱子冲一冲。
(3) 流动相是否符合液相色谱的要求?是否过滤处理?
柱子再生处理办法如下:
(1)依次用水,甲醇,四氢呋喃,氯仿,甲醇来冲洗柱子,每种溶剂5-10个柱体积。
(2)如果效果不明显,将柱子按以上顺序反冲,一般将大大降低柱子效果,不到不要没有办法才采用。
(3)如果效果还是不好,就需要打开色谱柱,超声波清洗筛片(这样也会使柱子效果下降)。必要时挖掉色谱柱内受污染部位,填入新的填料,还可用3个月。(填的时候小心,别重新污染柱子)
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第11楼2010/12/05
11 问:制备柱柱跑干了影响柱效吗?
答:如果时间不长的话,可以用流动相多冲几个小时.柱效不一定变化很大.如果时间太久,柱效一定变低. 具体造成影响有多大,要靠柱效测定来确定,而不是干柱时间的长短。如果跑干了,对于PUMP的影响可能还大些,所以最好先把管路中的空气抽走再说。
一般说来,制备柱子跑干,属于操作失当。柱子闲置不用时,最好冲入甲醇或其他有机溶剂,一定要把两头堵住密封,这样保留的时间会较长。
12 问:分析HPLC如何放大到制备型HPLC
答:在分析液相中色谱柱的典型进样量是微克级,甚至更低。样品量和固定相之比有的甚至小于1:10000。进样体积一般来说都大大小于色谱柱体积(小于1:100)。 在这种条件下,会达到很好的分离效果,峰形尖锐并且很对称。
分析系统线形放大到制备型HPLC意味着使用直径更大的制备柱、更高的流速和根据色谱柱的长度增加进样量并保持样品浓度不变。峰形仍会保持尖锐而对称。这种方法需要大型的色谱柱和大量的溶剂来分离较少的样品,但这种方法从经济上一般不合适。
在制备液相中,最大的区别就是超量进样。制备的分离峰形一般不可能仍会保持尖锐而对称,分析和制备是不同的概念。制备的首要概念是在达到纯化的基础上,降低成本,加快时间(提高效率)。一般说来,纯化的成本要高于生产粗产品的成本,所以,可以加大上样量,甚至过载,出现平头峰,而收集只集中在峰的一小部分,以来保证纯度,主要为了节省流动相和提高设备利用率。
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第12楼2010/12/05
13 问:制备纯化蛋白、多肽,耗用流动相惊人,请问这些用过的流动相(乙腈,甲醇)可以重蒸使用吗?
答:流动相用一般减压方法重蒸后,往往会形成有机溶剂和水会共沸,另外,由于减压蒸馏属于单次平衡,往往得不到100%纯度的溶剂,这会使溶剂的配置有一定困难,从而使色谱的重现性和分离度会发生一定的变化。如果要求不是很高的话,一般可以分析重蒸后馏分中的各组分含量,计算后再使用。
要通过重蒸得到纯物质是极其困难的,必须采用精馏塔多级蒸发,单就设备投资和能耗来讲,实验室规模或生产规模的废液回收处理已经是得不偿失。其实,我们没有必要得到纯的物质。
14 问:反相色谱分离纯化后,怎样除去流动相产品中的TFA和乙腈或其他杂质?
答: TFA是反相色谱分离中常用的添加剂。可以用冻干的办法去除,国外许多文献是这样报道的。还可以试试离子交换、凝胶层析、甚至透析和超滤,其中,离子交换层析效果比较好,还可以起到浓缩样品的作用。
首先,冻干的办法应该可以几乎彻底地除去TFA和乙腈,药物实验前最好先检测一下冻干品中的残留量,只要不超过允许范围,这种办法是最最简单、有效的。
其次,如果你的药物的分装量不大的话(<100ug),建议你用离子交换层析,最好装一个小一点儿的柱子,让含盐洗脱峰的蛋白浓度达10mg/ml以上,稀释后完全符合试验要求。如果用分子筛,考虑稀释,最好也先过一个离子交换。此外可以试试疏水层析。如果产品是碱的话,可能会形成TFA盐,这样通过上述方法就无法除去。一般可以用碱水洗,然后将产品萃取出来。或者在里面加入一定量的盐酸,再干燥后形成盐酸盐。